纳米孔测序揭示肺眼分巢共感染：高毒力与经典肺炎克雷伯菌的宿主生态位适应与进化博弈

本研究通过纳米孔全基因组与质粒测序技术，报道了一例罕见的高毒力（hvKp）与经典（cKp）肺炎克雷伯菌在免疫正常宿主肺部和眼部同时感染但基因型迥异的病例。研究揭示了hvKp（ST23/KL1型）携带rmpA/rmpA2、iuc、iro等毒力质粒，而cKp（ST133/KL116型）虽缺乏典型毒力因子却仍引发严重眼内炎。该发现强调了在特定生态位（如免疫豁免部位）中低毒力菌株的致病潜力，并为临床感染动态监测与精准治疗提供了重要见解。

　　

引言：高毒力与经典肺炎克雷伯菌的临床与分子分野

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）可分为经典菌株（cKp）和高毒力菌株（hvKp），二者在致病特征和感染模式上存在显著差异。cKp多见于医院内感染，通常感染免疫低下宿主，引起肺炎、尿路感染等机会性感染；而hvKp则能够侵袭健康个体，导致社区获得性重症感染如化脓性肝脓肿（PLA），并常伴随眼内炎、脑膜炎等转移性并发症。hvKp通常具备高黏液表型，常见KL1或KL2荚膜型，并携带一系列毒力因子，如位于大质粒上的rmpA/rmpA2（调节荚膜合成）、aerobactin（iucABCD/iutA）、salmochelin（iroBCDN）和peg-344，以及染色体上的yersiniabactin（ybt）和colibactin（clb）基因岛。相比之下，cKp通常缺乏这些毒力决定簇，荚膜型多样，很少引起转移性感染。

材料与方法：从临床样本到高质量基因组

本研究对象为一例25岁既往健康男性，在旅行期间出现高热、咳嗽，随后左眼突发视力模糊、红肿疼痛。CT影像显示双肺多发结节伴空洞、左眼内占位及肝脏低密度灶，提示肝脓肿。入院后经验性给予头孢曲松，后升级为美罗培南及左氧氟沙星。尽管全身感染逐步控制，左眼感染仍持续恶化，最终行眼内容物剜除术。肺泡灌洗液（BALF）和眼组织样本分离出两株肺炎克雷伯菌，分别命名为肺分离株（KP-L）和眼分离株（KP-E）。

细菌经哥伦比亚血琼脂和麦康凯培养基分离，VITEK 2 Compact系统鉴定。药敏试验采用肉汤微量稀释法，按CLSI M100（2024）判读。高黏液表型通过“拉丝试验”评估（≥5 mm为阳性）。基因组DNA提取后，基于Gseq-500平台进行纳米孔测序，采用Flye、NextDenovo、MIRA和nextPolish进行多步组装与抛光。毒力基因和耐药基因分别通过VFDB和AMRFinderPlus等数据库注释。多位点序列分型（MLST）和荚膜分型（Kaptive）用于分子分型，进化分析采用BUSCO_phylogenomics流程。

结果：基因型与表型的显著二分

测序质量与覆盖度

经质控后，KP-L和KP-E分别获得82,485条（459.9 Mbp，N50=8.7 kb）和123,909条（683.4 Mbp，N50=6.5 kb）有效读长，平均覆盖度分别为84×和130×，足以完成染色体和质粒的无缺口组装。

基因组结构差异

KP-L包含一条5.47 Mb染色体和一个~229 kb大质粒；KP-E则含5.25 Mb染色体和两个质粒（~145 kb和~11 kb）。总基因组大小KP-E比KP-L小约220 kb。

分子分型与进化关系

KP-L为ST23/KL1，属经典高毒力 lineage，毒力评分5/5（ybt+/clb+/iuc+）；KP-E为ST133/KL116，毒力评分0/5，属经典株。MLST显示两株在7个看家基因中有5个位点不同，系统进化分析证实它们无近期共同祖先。

毒力基因谱

KP-L携带典型hvKp毒力质粒，包含rmpA/rmpA2、iucABCD-iutA、iroBCDN、peg-344及染色体ybt岛和clb基因簇；KP-E则缺乏上述毒力因子，仅保留 entB（enterobactin）和荚膜合成基因。两株均只携带染色体bla_SHV，无获得性耐药基因，表型试验显示全敏感。

质粒结构特征

KP-L的pLung质粒（~229 kb）为IncFIB/IncHI1B型，毒力基因丰富但缺tra区域，推测为非接合型。KP-E的pEye质粒（~145 kb）属IncFIB(K)/IncFIIK，不含hvKp毒力基因，但携带银（sil）、铜（pco）、砷（ars）抗性操纵子，提示环境适应力强。

表型验证

KP-L拉丝试验阳性（字符串≥5 mm），呈高黏液表型；KP-E则为阴性，菌落干燥无光泽。药敏结果显示两株对测试抗生素均敏感。

讨论：感染动态、生态位适应与临床启示

感染动力学与菌株替代

本案例展示同一患者两个部位感染基因型截然不同的肺炎克雷伯菌：肺部为hvKp（ST23/KL1），眼部为cKp（ST133/KL116）。最可能的感染轨迹是：hvKp初始入血播散至眼，破坏血-眼屏障；后续抗生素压力抑制hvKp，眼部生态位空缺后被内源性cKp定植填补。hvKp大质粒带来代谢负担，在无抗生素压力时适应性差，而治疗中其广谱敏感性更易被抑制，cKp则凭借重金属抗性等适应性特征在损伤、免疫豁免的眼部环境中取得生长优势。

背景依赖性致病性与毒力基因丢失

尽管眼分离株缺乏典型hvKp毒力因子，却在免疫豁免的眼内引发严重感染，最终导致眼剜。这表明 virulence 高度依赖于感染微环境。眼部有限的免疫监视和炎症反应允许甚至低毒力菌大量增殖，并借助荚膜、LPS、生物膜形成等核心致病机制导致组织破坏。

生态位适应与毒力代价

hvKp与cKp在宿主内不同部位的分布可用适应性平衡解释：大质粒携带的毒力因子在系统感染中有优势（如应对宿主缺铁环境），但在特定生态位（如损伤眼部）则可能因代谢成本高而处于劣势。cKp的小规模重金属抗性系统成本低，且在炎症和组织坏死导致金属离子浓度升高的环境中更具持久性。

质粒生态与毒力-耐药收敛风险

KP-L的毒力质粒为非接合型，限制其水平转移；KP-E的质粒则具接合残留序列，提示潜在移动性。两者未发生基因交换实属幸运，否则可能诞生兼具高毒力和耐药性的杂交菌株。这警示需监测临床中hvKp与cKp共感染时质粒动态，防止“超级病原”出现。

临床与监测建议

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  早期识别应基于临床表现（社区发病、多器官脓肿、眼/CNS并发症等），并行快速分子检测（如rmpA/iucA PCR）及影像学检查；
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  毒力标记物应作为辅助而非金标准，因单点单次检测可能因质粒丢失或生态位差异导致假阴性；
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  推荐采用长读长或混合测序实时监测质粒获得/丢失，尤其在表型-基因型不符或聚集性病例中；
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  对高风险患者，应早期进行眼科评估和前房采样，感染明确时及时眼内注药或手术，以改善预后。

本研究通过纳米孔测序快速精准解析了同一宿主内不同生态位感染的菌株基因型，深化了对hvKp与cKp感染动态、适应进化及临床管理的理解，为未来实时监测、精准干预及防控高毒力-耐药融合株提供了重要范式。