溶杆菌T226的鉴定及其防控柑橘采后炭疽病的生防潜力与机制研究

本研究首次报道了从甘蔗根际土壤分离的溶杆菌属菌株Lysobacter enzymogenes T226，通过多相分类鉴定（16S rDNA系统发育分析、形态生理生化特征），证实其对柑橘采后炭疽病病原Colletotrichum gloeosporioides具有强且稳定的拮抗活性（抑制率80.3%）。该菌株在连续8次传代后仍保持高代谢稳定性，离体抑菌率达75.2%；体内生防试验显示，人工接种和自然感染条件下防效分别为78.2%和61.3%，其发酵液中的热不稳定活性物质可导致病原菌菌丝畸形、溶解。研究为开发新型生物农药（BCA）提供了理论依据和应用潜力。

　　

1 引言

柑橘（Citrus reticulata Blanco）是全球最重要的经济水果作物之一，年产量超过百万吨，但采后因生理衰变和病原侵染造成的损失严重。其中，由Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病是影响柑橘果实品质和商品性的主要采后病害。该病原可潜伏侵染，采后在高温高湿条件下显症，增加了防控难度。尽管化学杀菌剂仍是主要防治手段，但残留、抗药性及消费者对无残留产品的需求推动了安全、环保替代品的研发。利用拮抗微生物进行生物防治（BCA）是一种有前景的策略。

目前，针对柑橘其他采后病害（如Penicillium digitatum引起的绿霉病、Alternaria alternata引起的Alternaria腐病）的生防研究较多，但针对炭疽病的生防研究相对有限。Lysobacter属细菌广泛分布于土壤和水体，以其强大的拮抗活性著称，可产生裂解酶（几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶）、抗生素（如HSAF、WAP-8294A2）等活性物质，并具有竞争定殖能力。例如，L. enzymogenes菌株C3和OH11对草坪褐斑病、小麦赤霉病、番茄青枯病等防效超过80%，但尚无该属菌株防控柑橘炭疽病的报道。

本研究从广西南宁甘蔗根际土壤中分离到一株拮抗细菌T226，初步试验表明其对C. gloeosporioides有强离体拮抗作用。研究目的包括：（i）通过多相分类鉴定T226菌株；（ii）评估其离体拮抗稳定性；（iii）测定其在人工接种和自然感染条件下对柑橘采后炭疽病的体内防效。

2 材料与方法

2.1 试验菌株与培养基

生防菌T226分离自甘蔗根际土壤，采用营养琼脂（NA）培养基，30°C培养48小时，经三次纯化获得。供试病原包括10种真菌（如C. gloeosporioides “A”、“B”、C. musae、Rhizoctonia solani等）和4种细菌（如Xanthomonas oryzae pv. oryzae、Ralstonia solanacearum等），均保存于广西农业科学院微生物研究所菌种保藏中心。真菌用PDA培养基、细菌用NA培养基培养。

2.2 菌株T226的抗菌活性

2.2.1 拮抗作用与抑菌谱

采用平板对峙法，测定T226对柑橘炭疽病的抑制活性。病原菌菌饼（直径5 mm）接种于平板中心，T226菌株划线接种于3 cm外，28°C培养7天后测量菌落直径，计算抑制率：

抑制率（%）=（对照菌落净生长距离－处理菌落净生长距离）/对照菌落净生长距离 × 100

并测定T226对14种植物病原菌的抑菌谱。

2.2.2 发酵液抗菌活性检测

T226在营养肉汤中活化，按1:60接种，30°C、190 r/min摇培2天。制备三种发酵液：A（原液）、B（121°C高温灭菌20分钟）、C（离心取上清并细菌过滤）。以C. gloeosporioides为指示菌，采用滤纸片法测定活性。

2.2.3 对病原菌菌丝生长的影响

通过对峙培养，光学显微镜观察T226对C. gloeosporioides菌丝形态的影响。

2.3 拮抗活性稳定性评估

T226在NA斜面上连续传代8次（每15天一次），每次培养48小时后4°C保存。第八代后测定其对靶标病原的抑菌活性。

2.4 菌株T226对柑橘采后炭疽病的防效

2.4.1 人工接种病原的防效测定

健康柑橘果实腰部制造伤口（3×3 mm），接种20 μL T226菌悬液（2×10⁸ CFU/mL），以无菌水和200 mg/L prochloraz为对照。24小时后接种C. gloeosporioides分生孢子悬液（10⁴/mL），25°C、95%相对湿度贮藏。每日观察，记录腐果率和病情指数。病情分级：0级（无病）、1级（病斑面积<5%）、3级（6–10%）、5级（11–25%）、7级（26–50%）、9级（>51%）。

腐果率（%）= 腐果数/总果数 × 100

病情指数 = ∑（各级病果数 × 该级代表值）/（总果数 × 最高级代表值） × 100

防效（%）=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数 × 100

2.4.2 自然感病果实的防效试验

果实浸泡于T226菌悬液（2×10⁸ CFU/mL）、prochloraz（200 mg/L）或无菌水2分钟，晾干后用聚乙烯薄膜包装，室温贮藏。病斑出现后每日调查发病率和病情指数。

2.5 菌株T226的鉴定

采用多相分类法：形态特征（细胞形状、大小、鞭毛、菌落形态）、生理特性（生长温度、pH耐受、NaCl耐受）、生化特性（革兰染色、氧化酶、接触酶、碳氮源利用等）。16S rDNA用引物PF1（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和PR1（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增，PCR产物测序后BLAST比对，MEGA 11.0构建系统发育树。

2.6 数据统计与分析

采用DPS 9.1软件Duncan新复极差检验，p<0.05为差异显著。

3 结果

3.1 菌株T226的抗菌活性

3.1.1 对C. gloeosporioides的拮抗作用及抑菌谱

T226对C. gloeosporioides抑制率达80.3%，对11种真菌和4种细菌均有良好抑制效果，真菌抑制率50.1–71.1%，对细菌抑菌圈直径8.6–24.2 mm。

3.1.2 发酵液抗菌活性

高温灭菌发酵液（B）失去活性，无菌上清液（C）活性强于原液（A），表明活性物质热不稳定。

3.1.3 对病原菌菌丝生长的影响

T226导致C. gloeosporioides菌丝扭曲、缢缩、膨大、产生气泡，原生质凝集、外溢，菌丝断裂。

3.2 拮抗活性稳定性

连续传代8次后，平均抑菌率75.2%，第五代后下降约5个百分点后趋于稳定，无活性丧失。

3.3 对柑橘采后炭疽病的防效

3.3.1 伤口接种防效

贮藏20天后，对照发病率为93.3%，T226处理为20.0%；对照病情指数44.1，T226处理为9.6。T226防效78.2%，prochloraz为85.7%，差异显著。

3.3.2 自然感染防效

贮藏60天后，T226和prochloraz处理的腐果率分别为26.7%和36.7%，显著低于对照（73.3%）。T226防效61.3%，高于prochloraz（49.1%）。

3.3.3 菌株T226的鉴定

T226为革兰阴性杆菌，长1.9–2.1 μm，宽0.6–0.8 μm，无鞭毛，产黏液，滑动运动。生长温度10–37°C（最适31°C），pH 3–12（最适5.0）。NA上菌落圆形、直径约2 mm，光滑、边缘薄，浅黄色，产黑色素。

可利用碳源：葡萄糖、甘露醇、L-阿拉伯糖、海藻糖、乳糖；不可利用：麦芽糖、可溶性淀粉、D-半乳糖、菊糖、木糖醇。可利用氮源：L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、硝酸铵、尿素、硫酸铵、氯化铵；不可利用：DL-天冬氨酸。

生理生化反应：淀粉水解、硫化氢试验、Tween 80、柠檬酸盐利用、葡萄糖产酸、明胶水解、接触酶、需氧阳性；M.R.试验、吲哚试验、氧化酶阴性。可在2% NaCl生长，>3%不生长。

16S rDNA序列与Lysobacter enzymogenes（登录号EU430118）同源性99%，系统发育树显示100%支持度与L. enzymogenes聚类。菌株序列注册于GenBank（登录号GU361114）。基于形态、生理生化及遗传结果，将T226鉴定为L. enzymogenes。

4 讨论

本研究首次报道L. enzymogenes T226作为高效、稳定的柑橘采后炭疽病生防菌。其分类地位明确，具经典形态特征和滑动运动。广谱抗菌活性使其有望防控多种采后病害（如Penicillium、Alternaria），优于窄谱制剂（如Candida oleophila）。

连续传代后活性稳定（抑菌率75.2），利于大规模发酵。体内防效显著，人工接种防效78.2%（接近prochloraz的85.7%），自然感染防效61.3%（优于prochloraz的49.1%），表明实际应用潜力。

活性物质热不稳定，可能为蛋白质类抗生素或大环化合物（如HSAF），导致菌丝畸形、溶解。细胞游离上清液活性证实可扩散性。

未来需优化发酵条件、解析活性物质、开发制剂（如微胶囊）、评估生态安全和消费者安全性。

5 结论

L. enzymogenes T226是防控柑橘采后炭疽病的新型生防菌，具广谱抗菌性、高稳定性及显著防效，为开发替代化学杀菌剂的可持续策略提供了基础。