基于巨噬细胞乳酰化相关通路的慢性阻塞性肺疾病转录组标志物鉴定及机制研究

本研究通过整合生物信息学分析与临床样本验证，揭示了ALDH2、ASGR2和CYP1B1作为慢性阻塞性肺疾病（COPD）中与巨噬细胞乳酰化（Lactylation）相关的关键生物标志物。研究运用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习算法及分子对接等技术，构建了能够预测COPD患者死亡风险的列线图模型，并发现这些标志物富集于代谢通路和B细胞受体信号等途径。该发现为COPD的早期诊断和免疫靶向治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。

　　

3.1 Identification of MRGs

研究首先利用xCell算法评估了GSE100153数据集中COPD组与对照组之间34种免疫细胞的浸润水平。结果显示，9种免疫细胞类型的浸润水平存在显著差异，其中巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞表现出明显区别。鉴于巨噬细胞在COPD发病机制中的关键作用，研究选择这三种巨噬细胞亚型作为表型性状进行WGCNA分析。在剔除异常样本并确定软阈值为5（R² > 0.8）后，构建了尺度无关网络，共识别出30个基因模块。其中，有三个模块与巨噬细胞表型性状显著相关（相关系数 > 0.3，P < 0.05），这些模块内的基因被定义为巨噬细胞相关基因（MRGs）。

3.2 Function of candidate genes in COPD

差异表达分析在COPD组与对照组之间共鉴定出341个差异表达基因（DEGs），包括106个上调基因和235个下调基因。通过相关性分析，确定了3，667个与巨噬细胞乳酰化相关的基因（MLRGs）。将DEGs与MLRGs取交集后，获得47个候选基因。对这些候选基因进行功能富集分析发现，它们显著富集于390个GO功能条目，包括正调控磷脂酶C活性（生物过程）、ficolin-1-rich granule lumen（细胞组分）和甘露糖结合（分子功能）等。KEGG通路分析表明，候选基因主要参与组氨酸代谢等5条通路。这些结果提示候选基因可能参与磷脂酶调控、分子结合或代谢过程。

3.3 Three biomarkers in COPD

为了筛选可靠的生物标志物，研究结合了Boruta算法和SVM-RFE算法。Boruta算法筛选出17个关键基因，SVM-RFE算法筛选出47个基因，两者交集得到17个候选基因。对这17个基因进行ROC曲线分析，并在GSE100153（训练集）和GSE124180（验证集）两个数据集中验证。结果显示，ALDH2、ASGR2、CYP1B1、CATSPER1和GM5这五个基因在两个数据集中的AUC值均大于0.7。进一步表达水平分析发现，仅有ALDH2、ASGR2和CYP1B1在COPD组中的表达水平显著高于对照组，且表达趋势在两个数据集中保持一致。因此，ALDH2、ASGR2和CYP1B1被确定为最终的生物标志物。进一步的转录因子（TF）预测分析发现，有154个TFs与这三个标志物相关，其中STAT3、SOX9、TFAP4、IKZF2和TP63这5个TFs同时靶向所有三个标志物。

3.4 Ability of biomarkers to predict COPD mortality

基于已识别的三个生物标志物，研究构建了一个列线图（Nomogram）模型来预测COPD患者的死亡风险。该模型根据每个标志物的表达水平赋予相应分数，总分越高，患者的死亡风险越高。模型评估显示，其AUC值达到0.893，决策曲线分析（DCA）也表明模型具有较高的净收益，证实了该列线图模型在预测COPD死亡率方面的准确性和可靠性。

3.5 Enrichment pathway of biomarkers

为了探索生物标志物可能参与的生物学通路，研究进行了基因集富集分析（GSEA）。结果显示，CYP1B1主要富集在翻译、核酸分解代谢和RNA加工等359条通路；ALDH2参与微绒毛组装和抗菌体液反应等517条通路；ASGR2则与B细胞受体信号通路、伤口愈合和抗菌体液反应等32条通路相关。这些发现表明，这些生物标志物可能与代谢过程、B细胞受体通路以及抗菌体液免疫应答密切相关。

3.6 Ability of compounds to bind to biomarkers

通过数据库搜索，研究发现了59种与生物标志物相关的化合物，其中8种化合物与多个标志物相关联，包括砷、苯并（a）芘和双酚A等。对其中5种可获得蛋白结构的化合物进行了分子对接验证。结果显示，ASGR2与CGP 52608、苯并（a）芘和双酚A均表现出较强的结合亲和力。CYP1B1也与苯并（a）芘、双酚A和CGP 52608有显著的结合能力，其中与苯并（a）芘的结合能最强，为-6.17870951 kcal/mol。这些结果为后续靶向药物开发提供了线索。

3.7 Expression levels of biomarkers in clinical samples

最后，研究通过RT-qPCR实验对5例COPD患者和5例对照者的全血样本进行了验证。结果证实，与对照组相比，COPD患者血液中ALDH2、ASGR2和CYP1B1的mRNA表达水平均显著升高，与生物信息学分析结果一致，进一步支持了这三个基因作为COPD潜在生物标志物的可靠性。

4 Discussion

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种全球性的健康负担，其发病机制涉及遗传易感性、环境暴露和免疫应答失调等多种因素。巨噬细胞作为先天免疫的关键细胞，其M1/M2极化状态以及近年来发现的乳酰化修饰在COPD免疫微环境调控中扮演着重要角色。本研究成功鉴定了ALDH2、ASGR2和CYP1B1这三个与巨噬细胞乳酰化相关的COPD新型生物标志物。

ALDH2是乙醛代谢的关键酶，其活性降低与多种疾病易感性增加相关。本研究发现在COPD中ALDH2表达上调，提示其可能通过乳酰化修饰参与COPD的发病过程。ASGR2是去唾液酸糖蛋白受体的一个亚基，主要参与糖蛋白的内化和降解。本研究首次报道了ASGR2在COPD中的表达升高及其潜在诊断价值。CYP1B1是细胞色素P450酶家族成员，参与外源性物质代谢和炎症反应。本研究证实CYP1B1在COPD中高表达，且与苯并（a）芘等环境污染物有强结合力，暗示环境因素可能通过影响CYP1B1参与COPD发生。

研究还发现，这些标志物富集的通路涉及代谢、B细胞受体信号等，这与COPD存在的慢性炎症和免疫失调特征相符。预测的转录因子如STAT3、SOX9等，是已知的炎症和细胞分化关键调控因子，它们可能共同调控这些标志物的表达。分子对接筛选出的化合物则为未来靶向治疗研究提供了方向。

5 Conclusion

本研究通过综合生物信息学方法和实验验证，揭示了ALDH2、ASGR2和CYP1B1作为COPD中与巨噬细胞乳酰化相关的关键生物标志物。它们不仅与免疫细胞浸润、代谢通路调控密切相关，所构建的预测模型也显示出良好的临床应用潜力。这些发现为理解COPD的免疫代谢机制提供了新视角，并为开发早期诊断方法和靶向治疗策略提供了新的候选靶点。