轮作系统中土壤微生物群落动态：季节性与作物特异性效应的交互作用

本研究通过整合高通量DNA测序与土壤化学分析，深入探讨了长期轮作系统中不同作物及其生长阶段对土壤微生物群落多样性、组成和功能特性的影响。结果表明，相较于作物种类，季节性因素和土壤理化性质（如电导率）对微生物β多样性具有更显著且一致的调控作用；尽管存在分类组成变化，以酸杆菌门（Acidobacteriota）和芽孢杆菌属（Bacillus）为核心微生物组在不同作物和季节中保持稳定。功能预测揭示硝化潜力在温暖季节达到峰值，表明该过程主要受环境而非作物驱动。这些发现强调了季节性和非生物因素在塑造微生物群落动态中的主导作用，为优化农业实践、维持微生物功能性和促进长期土壤健康提供了科学依据。

　　

1 引言

土壤微生物群落在维持土壤健康、肥力和生态系统功能中发挥着核心作用。这些由细菌和真菌组成的多样化群落负责养分循环、有机质分解和土传病害抑制等关键过程。在农业系统中，土壤微生物群落的结构和功能受到土壤特性、作物种类、管理实践和季节动态等多种因素的复杂交互影响。

作物轮作是一种广泛采用的农业实践，旨在改善土壤肥力、打破病虫害循环并提高作物生产力。然而，不同作物及其生长阶段如何影响土壤微生物多样性和群落组成仍是当前研究的热点课题。虽然植物根系通过释放根系分泌物等机制塑造根际微生物组的观点已被广泛接受，但作物特性与环境因素（如土壤类型、pH值、水分和季节变化）的相对重要性仍不够明确。

近年来，高通量测序和分子分析技术的进步使得研究人员能够更详细地探究作物轮作和季节变化对土壤微生物群落的影响。这些研究揭示，尽管植物物种可以对土壤微生物产生一定影响，但其效应往往依赖于环境背景，并可能被非生物因素和时间变异性所掩盖。理解土壤微生物稳定性和变化的驱动因素对于制定支持长期土壤健康和生产力的可持续农业实践至关重要。

2 材料与方法

2.1 站点描述与样品采集

本研究利用2019年从佩鲁贾大学FIELDLAB进行的Biosyst长期试验中收集的土壤样品。样品来自采用常规低投入系统管理的田块，土壤类型为Fluventic Haplustept，包含26.3±1.3%砂粒、38.5±1.2%粉粒和35.2±1.0%粘粒，pH值为8.04±0.11，土壤有机质含量为1.46±0.05%。

自2001年10月起，实施了6年作物轮作，固定作物序列为：(1)玉米(C)、(2)加工番茄(T)、(3)硬粒小麦(DW)、(4)蚕豆(FB)、(5)甜瓜(M)和(6)普通小麦(CW)。为在每年容纳所有六种作物，田地分为六个区域，采用六种不同的轮作安排(R1–R6)，每种轮作从不同作物开始。

使用4厘米直径的钻探工具采集0-20厘米表层土壤。在每个区域选择四个采样点，每个采样点随机采集四个岩心，混合后作为单个生物重复存储在-80°C下。采样于2019年3月27日、6月20日和9月6日进行。

2.2 DNA提取与扩增子测序

使用FastDNA Spin Kit for Soil从每个土壤样品中分离宏基因组DNA。采用引物Pro341F和Pro805R靶向16S rRNA基因的V3–V4区域进行PCR扩增。扩增子由BMR Genomics处理成测序文库，使用Illumina MiSeq平台进行双端300 bp测序。所有测序数据已保存在Sequence Read Archive中，登录号为PRJNA1053916。

2.3 土壤CE、pH和FT-IR分析制备

土壤样品风干后过2 mm筛。将3 g土壤子样品以1:5的重量体积比悬浮于无菌蒸馏水中，振荡2小时后静置15分钟。上清液用于测量电导率(EC)、pH和傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析。使用EC-Meter GLP 31测量EC，使用台式pH计测量pH值。对于FT-IR光谱分析，收集30 μl上清液分成三个10 μl技术重复，铺在384孔硅胶板上。

2.4 数据分析

2.4.1 元条形码分析

所有序列预处理和分类学分类步骤均遵循标准DADA2工作流程，使用R中的dada2包。原始读数根据质量谱进行过滤和修剪，以去除低质量碱基和读数。流程包括错误率学习、去重复、精确序列变体(ASVs)推断、双端读数合并和嵌合序列去除。使用DADA2中实现的朴素贝叶斯分类器对SILVA 138 SSU参考数据库进行分类学分配。

使用Vegan和microeco包计算α和β多样性指标。α多样性指数包括香农多样性指数、辛普森均匀度、Chao1丰富度估计值和观察到的ASVs数量，而β多样性使用Bray-Curtis相异度指数评估。由于数据不满足正态性或方差齐性假设，应用非参数统计检验评估相对丰度和多样性指标的差异。

通过主坐标分析(PCoA)可视化β多样性模式，并使用PERMANOVA检验其统计显著性。此外，使用距离基于冗余分析(db-RDA)探索β多样性与环境变量之间的关系。使用phyloseq包定义核心微生物组，识别在至少90%样品中以最小相对丰度阈值0.5%存在的ASVs。使用microeco包通过FAPROTAX推断原核生物群落的功能潜力。

2.4.2 FT-IR分析

FTIR测量在透射模式下进行，光谱记录范围为4,000–400 cm^-1，光谱分辨率为4 cm^-1。每个样品采集256次扫描。使用OPUS软件进行光谱处理，包括质量评估、基线校正、矢量归一化和二阶导数计算。技术重复取平均获得代表性光谱，随后用于统计分析。

在衍生化前对平均原始光谱进行峰挑选，而统计检验在衍生光谱上进行。使用波长逐波长t检验和主成分分析(PCA)来识别显著不同的光谱波长并探索整体光谱变异性。

3 结果与讨论

3.1 三个采样时间轮作作物的α和β多样性

六种不同物种的轮作作物在三个采样时间表现出不同的生长阶段。3月份，冬季作物(蚕豆、普通小麦和硬粒小麦)处于绿色活跃生长状态，而夏季作物(番茄、玉米和甜瓜)尚未种植，土壤裸露。6月份，冬季作物达到成熟期，植被干燥，而夏季作物处于完全营养生长阶段。9月份，冬季作物和甜瓜已收获，土壤仅剩秸秆覆盖。玉米和番茄处于成熟期，植被干燥，番茄植株上还有一些剩余的果实。

为了评估土壤微生物群作为作物阶段和特定作物功能的变异，在裸露土壤和有植被植物的土壤之间以及六种作物之间比较了α和β多样性。

3月份，所有α多样性指标均未显示裸露土壤地块与绿色植被地块(即夏季和冬季作物地块)之间的微生物群存在统计学显著差异；同样，各个轮作作物之间也未观察到显著差异。基于Bray-Curtis指数的PCoA图中的β多样性也显示了类似结果，生长阶段变量之间没有可检测的空间分离。当考虑单一作物作为变量时，PCoA显示在PCo1上DW和CW紧密聚集在一起，而蚕豆和夏季作物重叠，番茄最为分散。

6月份，α多样性未显示绿色植被(夏季作物)和干燥植被(冬季作物)地块之间存在任何显著差异，单一作物之间也是如此。β多样性分析显示基于植被阶段的一些聚类，特别是在PCo 2上，两组明显分离。

当考虑作物变量时，与3月份采样相比出现了更明显的聚类。冬季作物与甜瓜形成独立的聚类，而玉米和番茄与蚕豆聚类略有重叠。

9月份采样与3月份相似，α多样性没有显著差异，β多样性方面也没有差异，秸秆覆盖样品(冬季作物和甜瓜)与干燥植被样品(玉米和番茄)在PCoA图上重叠。与3月份采样不同，当将PCoA分析与作物种类变量结合时，观察到三个主要分组：硬粒小麦和普通小麦聚集在一起，玉米和甜瓜也是如此(尽管处于不同的生长阶段)，番茄和蚕豆也是如此(也处于不同的生长阶段)。

当考虑不同采样点和采样时间的所有样品时，基于采样时间观察到明显的分组。9月份样品紧密聚集在一起，与6月和3月样品明显分离，后者反而重叠。

结果表明，在所研究的轮作系统中，作物生长阶段和作物种类对土壤微生物多样性和组成的影响相对较小且依赖于环境背景。在所有三个采样期间，α多样性在裸露土壤和植被地块之间或六种作物物种之间没有显示显著差异。这表明植被的存在以及特定作物并未一致影响土壤微生物群落的整体丰富度或均匀度。

3.2 作物轮作和采样时间内β多样性和土壤理化参数的变化

使用基于距离的冗余分析(dbRDA)检查了土壤β多样性与理化因素(特别是pH和电导率(EC))之间的关系。3月份，前两个dbRDA轴(dbRDA1和dbRDA2)共同解释了总变异的78.6%。pH与dbRDA1呈正相关，而EC与dbRDA2呈正相关。这些环境变量影响了土壤群落的聚类，特别是在采样时存在冬季作物的田区。在这些区域，样品按作物种类紧密聚集。相反，计划种植夏季作物的未种植田地(即裸露土壤)显示出较弱的聚类和较大的重叠，主要沿dbRDA1轴。

总体而言，土壤条件，反映在pH和EC上，似乎是群落结构的关键驱动因素，植被田地(冬季作物)的样品沿dbRDA1与裸露土壤样品(夏季作物)明显分离。

6月份，当所有田地都被绿色植被(夏季作物)或干燥生物量(冬季作物)覆盖时，沿第一个dbRDA轴观察到明显分离，该轴占总变异的56%。普通小麦和硬粒小麦样品紧密聚集在一起，而蚕豆样品沿第二轴(dbRDA2)分布更广，该轴解释了额外的24.8%变异。

到9月份，样品在排序空间中的分散度增加。每个田地的土壤样品，其中四个现在含有秸秆覆盖且没有活跃作物，形成不同的分组，只有与小麦相关的样品保持紧密聚集。土壤条件继续驱动样品分离，在dbRDA中可见对角线梯度，但此时这种空间分离没有统计显著性支持。

在所有采样期间(3月、6月和9月)，pH始终表现为短向量，表明对微生物群落结构的影响相对较弱，这一观察得到了作物类型间pH缺乏统计学显著差异的支持。相反，EC始终由较长向量表示，表明对微生物组成的影响更强。

当将所有样品合并到同一dbRDA分析中时，出现了两种不同的分离模式。当考虑采样时间和作物变量时，两个主要分离很明显：沿dbRDA1轴，作物变量起主导作用，小麦向量几乎与轴平行指向左侧，而蚕豆向量指向相反方向。值得注意的是，小麦样品聚集在图的远左端，表明小麦与其他作物之间存在强烈分化。这表明作物类型影响了沿该轴的理化参数变异。

沿dbRDA2轴，分离主要由采样时间驱动。9月份样品明显分组到图的下部，即将3月和6月采样的小麦土壤群落与9月采样的分离开。这表明采样时间具有强烈影响，不同时间采集的样品(9月与3月和6月)之间存在明显区别。

3.3 跨作物种类、作物生长阶段和采样时间的优势属分类分析

在所有作物物种和采样时间中，有六个属位列前十。具体而言，三个属属于放线菌门(Actinobacteriota)：Haliangium、Bryobacter和Lysobacter。两个属属于变形菌门(Proteobacteriota)：RB41和MND1，而一个属Bacillus属于芽孢杆菌门(Bacillota)。三个属存在于除一个之外的所有微生物群落中。Massilia(变形菌门)不在番茄样品的前10属中，Ellin(放线菌门)在蚕豆样品的前10属中缺失，Nitrospira(硝化螺旋菌门)不在普通小麦样品的前10属中。

其他存在于前十的属包括Ramlibacter(放线菌门；仅存在于DW和CW样品中)、Solibacter(酸杆菌门；CW样品)、Flavisolibacter(酸杆菌门；不存在于CW和DW中)、UTBCD1(仅存在于FB样品中)和Niastella(放线菌门；仅存在于番茄样品中)。

在冬季作物中，DW中的三个采样时间在PCA图中形成不同的聚类，解释了总变异的70.1%。这些聚类主要由四个关键类群分离：Massilia、RB41、Bacillus和Haliangium。在CW中，尽管解释变异性更高(89.7%)，但采样时间之间的分离不太明显，Haliangium和Bacillus成为主要驱动因素。最后，在蚕豆中，PCA图(81.5%解释变异性)未显示采样时间之间的明显聚类，但Bacillus和Haliangium再次成为优势类群，与CW中观察到的相同。

在夏季作物中，基于分类相对丰度的PCA图均未显示明显分组。甜瓜样品在PCA空间中广泛分散(总变异性解释为67.5%)，Haliangium和Bacillus是主要贡献类群。在番茄中，6月(绿色植被)和9月(干燥植被)样品聚集在一起，而3月样品(裸露土壤)更为分散。关键驱动因素包括RB41、Bacillus和Haliangium(77.8%解释变异性)。对于玉米，3月和6月样品(裸露土壤和绿色植被)沿第一主成分(PC1)明显分离，而9月样品与两个时间点部分重叠(79.8%解释变异性)。

3.4 跨作物预测硝化活性的时间变化

使用原核生物分类功能注释(FAPROTAX)基于测序数据的分类学分配预测土壤样品的原核生物群落功能谱。除了提供整体群落水平的功能预测外，FAPROTAX还能够推断与单个类群相关的特定特征和功能。将分类谱与FAPROTAX数据库进行映射，以推断检测到的原核生物的潜在生物地球化学功能。因此，推断的功能代表潜在能力而非原位观察到的代谢功能。

在预测的功能谱中，选择与硝化相关的功能进行更详细的分析。所有作物在三个采样时间(3月、6月和9月)进行了分析。所有作物在6月份表现出硝化谱的相对丰度峰值。

所有冬季作物在6月份与3月和9月相比显示出硝化谱的显著增加。玉米、甜瓜和番茄也在6月份表现出峰值，表明不同作物的硝化活动存在季节性趋势。这种模式表明，环境因素(如温度，在温暖月份(6月和9月)达到峰值)可能比作物类型更能影响土壤中的硝化过程。

3.5 作物间核心微生物组变异

在每个作物类型和采样月份中超过90%样品中存在且最小相对丰度为0.5%的ASVs被定义为核心微生物组。为了评估每个采样月份内作物类型的影响，将这些ASVs在属水平上进行分组后分析核心群落的变化，以检测主要的组成变化。

3月份，在所有轮作作物中共鉴定出11个属(21个ASVs)作为核心微生物组的一部分。具体而言，CW和FB的核心微生物组各包括6个属，而DW有5个。在采样时土壤裸露的夏季作物中，甜菇显示最多核心属，有8个，其次是番茄有7个，玉米仅有4个。只有两个属，均属于酸杆菌门并在核心属中显示最高相对丰度，存在于所有轮作作物中。采样时，DW和FB的核心微生物组非常相似，仅差一个属。甜菇(M)和番茄(T)也是如此，它们的核心也仅差一个属。总体而言，核心微生物组主要由来自酸杆菌门的属组成，其次是Bacillus。值得注意的是，只有CW包括两个来自变形菌门的属(Massilia和Lysobacter)，而Nitrospira仅在甜菇中发现。

6月份，具有绿色植被的夏季作物表现出几乎相同的核心微生物组，除了番茄比其他人少一个属。具体而言，甜菇(M)和玉米(C)的核心各包含10个属，其中七个属于酸杆菌门，而番茄的核心包括该门的六个属。其余三个核心属Bacillus、Nitrospira和MND1在所有三种作物中一致。在采样时具有干燥植被的冬季作物中观察到更大的变异。具体而言，只有三个属RB41、来自Blastocatellaceae科的一个未知属和Bacillus被所有三种轮作作物共享。其中，DW和FB共享更多属(7个)，表明更接近的相似性。总体而言，6月份六种作物共享三个属，与3月份相似，属于酸杆菌门的那些最为丰富，其次是Bacillus。

9月份，相同的三个核心属仍然最为丰富，但优势向Bacillus转移，Bacillus成为最普遍的属。玉米(C)和番茄(T)是仅存的具有植被的作物，表现出相似的核心微生物组，在九个属中仅差一个属。具有秸秆覆盖的四种作物零星共享一些核心属，但没有明显的模式或趋势。

核心微生物组在所有采样时间基本保持稳定，仅显示轮作作物之间的微小变异且主要存在相同的属。显著的例外包括仅在3月CW中发现的Massilia和Lysobacter；仅在6月蚕豆中存在的UTBCD1属(来自Chitinophagaceae科)；以及在6月所有作物 except CW中检测到并在9月仅在甜菇中检测到的MND1属(Nitrosomonadaceae科)。

3.6 基于FTIR的土壤分析

对所有作物在每个采样时间的土壤样品进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。识别了17个特征峰(p1–p17)，分析仅限于与这些峰对应的波长区间。

为了探索植被阶段和作物种类对土壤光谱谱的影响，将PCA应用于FTIR数据并可视化为双图。双图显示了对应沿前两个主成分分离贡献最大的波长的三个主要载荷。3月份，PCA未显示基于植被阶段的样品明显分离。植被阶段之间的波长特异性t检验比较仅识别出有限数量的波长，属于七个不同的峰，显示统计学显著差异(p2–3、p8–10、p15和p17)。同样，以作物类型作为分组因子进行的PCA在3月份未显示样品之间的明显分离。此时，对沿前两个主成分分离贡献最大的波长 specifically 668、483和660 cm^-1。这些波长分别属于峰p14、p16和p15，所有这些都与矿物信号相关。置换多元方差分析进一步证实了这种模式，表明作物类型和植被阶段对土壤光谱谱均无统计学显著影响。

6月份，PCA再次显示基于植被阶段的样品无明显分离。Adonis2证实了缺乏显著效应。6月PCA的三个主要载荷对应波长3,657、481和1,206 cm^-1，分别属于峰p1、p16和p3。峰p1归因于矿物信号，特别是来自粘土和硅烷醇的自由–OH基团，没有可能的微生物来源。峰p16与硅酸盐和石英(矿物信号)相关，而峰p3对应微生物/有机信号，包括C–O和C–N伸缩、碳水化合物、磷酸盐和可能的微生物多糖。6月的波长特异性t检验揭示了有限数量的显著波长，属于峰p2、p3、p6、p7、p9、p10、p14和p16。其中，峰p2、p9、p10、p14和p16为矿物来源；峰p3与微生物或有机来源的碳水化合物相关；峰p6和p7与有机和矿物信号都相关。

9月份，PCA再次未显示基于植被阶段或作物类型的任何明显分离。这进一步得到adonis2的证实，显示两个因素均无统计学显著效应。9月PCA的三个主要载荷对应波长1,009、1,011和1,013 cm^-1，均属于峰p7。该峰与有机和矿物信号都相关，反映了强烈的硅酸盐贡献但可能有微生物多糖。有趣的是，9月是通过t检验比较检测到显著波长数量最多的月份。只有峰p3、p10、p11和p17未显示任何显著波长。

总体而言，通过FTIR评估的土壤代谢组是不同时间点采集样品之间差异的良好指标，特别是在3月和9月之间。相反，这种方法未能有效检测与作物类型或植被阶段相关的差异，因为PCA和PERMANOVA分析一致显示这些因素没有明显分离或统计学显著效应。此外，通过元条形码分析观察到的作物和植被阶段之间的差异未反映在FTIR获得的代谢组谱中，表明微生物群落变化不一定转化为该技术捕获的批量土壤化学指纹的可检测变化。

4 结论

本研究表明，在所检查的作物轮作系统中，土壤微生物多样性和群落组成更多由土壤性质和季节变化驱动，而非作物种类或生长阶段。虽然植物可引起微生物群落的短期变化，但这些效应通常较小且临时。一个稳定的核心微生物组在不同作物和季节中持续存在，可能支持关键土壤功能，如养分循环和有机质分解。

季节因素，包括残留物分解和环境变异性，强烈影响微生物群落和土壤化学，突出了在土壤管理中考虑时间动态的重要性。

未来研究应专注于更精细尺度的采样，结合宏基因组学或宏转录组学进行功能分析，并评估土壤理化变量以阐明驱动微生物动态的机制。此外，了解作物残留物和覆盖对微生物演替的影响对于制定促进长期土壤健康和农业生态系统可持续性的可持续残留物管理策略至关重要。