南中国海东方多角海蛞蝓（Polybranchia orientalis sp. nov.）完整线粒体基因组揭示其系统发育地位与潜在光合能力

本研究首次报道了在南中国海发现的东方多角海蛞蝓新种（Polybranchia orientalis sp. nov.），通过整合形态学、线粒体基因组（14,452 bp，含13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs）和系统发育分析，证实其属于Caliphyllidae科。该物种具有独特的羽毛状cerata结构和65.55%的AT偏好性，并检测到藻类叶绿体基因（相似度＞95%），提示存在盗食质体（kleptoplasty）现象，为研究海洋生物适应性进化提供了新模式种。

　　

1 引言

线粒体基因组（mtDNA）作为细胞器的遗传物质，具有分子量小、结构相对保守、进化速率适中以及母系遗传（通常无重组）等特点，是研究物种系统发育、群体遗传结构、比较基因组学和分子进化机制的核心标记之一。近年来，囊舌目（Sacoglossa）海蛞蝓研究在系统学和功能机制方面取得显著突破，整合分类学研究揭示了广泛的隐存多样性，功能生态学研究则阐明了盗食质体（kleptoplasty）的环境适应机制。然而，由于种群密度低和有效的拟态防御机制，海蛞蝓样本获取仍具挑战性，许多物种尚未被鉴定。在南中国海的野外调查中，发现了一种与东方多角海蛞蝓（Polybranchia orientalis）外部形态特征极为相似的物种，暂命名为东方多角海蛞蝓新种（Polybranchia orientalis sp. nov.），本研究旨在通过线粒体基因组序列分析和外部形态特征详细检查，对其进行全面鉴定和系统发育分析。

2 材料与方法

2.1 样本采集、基因组DNA提取与质量评估

样本于2024年6月低潮期间采集自中国海南省三亚市沿海地区（经度：109.496745，纬度：18.2069），取其叶状cerata组织保存于95%乙醇中。使用快速组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳评估质量。

2.2 引物设计、PCR扩增与测序组装

针对线粒体DNA保守区域设计引物，扩增cox1、16S、nd1、cytb、12S和nd4等短片段，基于这些保守序列设计特异性引物，通过多次PCR反应扩增剩余线粒体DNA序列。PCR反应使用LA Taq聚合酶，条件为：94°C初始变性2分钟，随后35个循环的94°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸1分钟/kb，最后72°C终延伸10分钟。PCR产物直接测序或克隆至pMD18-T载体后测序，使用ABI 3730自动测序仪进行Sanger测序。所有片段经质量验证和BLAST确认后，使用DNAstar v7.1逐步组装线粒体基因组。

2.3 序列注释

使用MITOS网络服务器确定基因大致边界，通过搜索ORF（使用无脊椎动物线粒体遗传密码5）找到蛋白质编码基因（PCGs）的确切位置，使用ARWEN、DOGMA和MITOS识别所有tRNA，通过同源比对确定rrnL和rrnS的精确边界。

2.4 数据处理与分析

使用CGView服务器生成线粒体基因组图谱，使用MEGA version 12分析碱基组成、氨基酸使用和相对同义密码子使用（RSCU），使用公式AT-skew = (A - T)/(A + T)和GC-skew = (G - C)/(G + C)计算AT和GC偏斜值。

2.5 系统发育分析

从NCBI数据库下载23个与东方多角海蛞蝓新种高度相似物种的完整线粒体基因组序列，使用Phylosuite v1.2.3提取cox1基因和13个PCGs，使用MAFFT进行多序列比对，使用ModelFinder v2.2.0基于贝叶斯信息准则（BIC）选择最佳进化模型（GTR+F+I+G4），使用MrBayes 3.2.6进行贝叶斯推断（BI）分析，运行1,000,000代MCMC模拟，前25%样本树作为burn-in剔除。使用iTOL在线平台可视化和手动调整系统发育树。

3 结果

3.1 东方多角海蛞蝓新种的形态特征

该海蛞蝓形似一团棕色海藻，背部略扁平，头部有一对圆锥形触角。以藻类为食，体色随摄食藻类变化，呈棕色或绿色。身体饰有众多羽毛状cerata，扁平、扇状、边缘具齿，具细分支模式似叶脉。cerata易脱落，脱落后能粘附人体皮肤并在海水中运动，由多个具绿色色素颗粒结构组成。足部细长，前宽后窄。多数情况下为雌雄同体，通过交叉受精繁殖，产卵形成长螺旋带状结构，显微镜下可见众多发育中的胚胎。

3.2 东方多角海蛞蝓新种的线粒体基因组结构

线粒体基因组全长14,452 bp（GenBank登录号：PV637185），包含13个PCGs、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个非编码控制区。PCGs总长10,871 bp，tRNA基因1,415 bp，rRNA基因1,779 bp，控制区231 bp，分别占整个线粒体基因组的75.22%、9.79%、12.31%和1.60%。atp8、atp6、nad3、cox3、12S-rRNA和8个tRNA基因（trnQ、trnL2、trnN、trnR、trnE、trnM、trnS2、trnT）由L链编码，其余基因由H链编码。13个PCGs中识别出四种起始密码子：GTG、TTG、ATG和ATT，终止密码子包括TAA、TAG和不完全终止密码子T–。

3.3 线粒体基因组的核苷酸组成与偏斜性

核苷酸组成从高到低依次为T（37.43%）、A（28.12%）、G（18.27%）和C（16.18%），A+T含量占整个线粒体基因组的65.55%，G+C含量为34.45%。AT偏斜和GC偏斜值分别为-0.1421和0.0607，表明核苷酸组成存在明显的AT偏好。除rRNA外，整个线粒体基因组、tRNA和所有13个PCGs的AT偏斜值均为负值。13个PCGs中，cytb、atp8、atp6、nad3和cox3的GC偏斜值为负，其余PCGs、tRNA和rRNA的GC偏斜值为正。

3.4 线粒体蛋白质编码基因

13个PCGs总长10,871 bp，其中nad5最长（1,683 bp），atp8最短（159 bp）。相邻基因间存在多个重叠区域，包括nad6和nad5重叠2 bp，nad5和nad1重叠8 bp，nad4L和cytb重叠56 bp。相对同义密码子使用（RSCU）分析显示共有29个偏好密码子，最高RSCU值为2.13，最低为0.23。四个密码子RSCU值等于或大于2：UUA（Leu）、CCU（Pro）、ACU（Thr）和GCU（Ala），均以A或U结尾。

3.5 东方多角海蛞蝓新种的tRNA和rRNA基因

22个tRNA基因长度在58至68 bp之间，最长的为trnE和trnT，最短的为trnS2，总tRNA长度为1,415 bp。8个tRNA（trnQ、trnL2、trnN、trnR、trnE、trnM、trnS2、trnT）由L链编码，其余由H链编码。rRNA基因总长1,779 bp，包括12S rRNA和16S rRNA，分别位于L链和N链上。16S rRNA和12S rRNA长度分别为1,059 bp和720 bp，总体A+T含量为65.09%，核苷酸组成为A=35.19%、T=33.45%、G=17.38%、C=14.00%。12S rRNA基因位于trnM和trnE之间，16S rRNA基因位于trnV和trnL1之间。16S rRNA与trnV重叠6 bp，12S rRNA与trnE重叠4 bp。两个rRNA基因的AT偏斜（0.0254）略低于GC偏斜（0.0175），表明存在G和C核苷酸偏好。

3.6 系统发育分析

基于cox1序列的系统发育分析显示，该物种首先与东方多角海蛞蝓（P. orientalis）聚在一起，然后与同属序列（如墨西哥多角海蛞蝓P. mexicana、施氏多角海蛞蝓P. schmekelae、简氏多角海蛞蝓P. jannae）形成Caliphyllidae科内的一个独立分支。由于东方多角海蛞蝓的完整基因组序列目前不可用，使用其他海蛞蝓的13个PCGs进行了额外的系统发育分析，显示该物种聚集在包含Plakobranchidae科几个物种的分支内。形态上，该海蛞蝓与东方多角海蛞蝓相似，均呈团块状似棕色海藻，背部具羽毛状cerata。关键区别在于cerata：东方多角海蛞蝓的羽毛状cerata近乎透明，遍布肉桂棕色斑点，并有两个背中黄色斑块，而东方多角海蛞蝓新种的cerata伴有绿色色素颗粒结构。Plakobranchidae科的海蛞蝓（如细巧 Thuridilla gracilis、华丽Elysia ornata、眼斑Plakobranchus ocellatus）与东方多角海蛞蝓新种存在显著形态差异。这些系统发育和形态学发现支持将该海蛞蝓归入多角海蛞蝓属（Polybranchia），称为东方多角海蛞蝓新种（P. orientalis sp. nov.）。

3.7 东方多角海蛞蝓新种的盗食质体现象

从cerata（非全身）提取DNA，检测到叶绿体相关基因序列。BLASTn分析显示，东方多角海蛞蝓新种中鉴定出的叶绿体基因序列与多种物种的叶绿体基因组高度相似（>95%），其中叶状隐甲藻（Kryptoperidinium foliaceum，96.53%）、沙生舟形藻（Navicula arenaria，96.53%）和巴西伪菱形藻（Pseudonitzschia brasiliana，96.95%）相似度最高。结果初步证明该物种具有囊舌目主要特征之一，即盗食质体（kleptoplasty），字面意为“被盗质体”，表明东方多角海蛞蝓新种可利用藻类叶绿体进行光合作用并为自身提供能量，这在动物适应性进化过程中具有重要意义。

4 讨论

本研究首次报道了在南中国海地区鉴定出的东方多角海蛞蝓新种（P. orientalis sp. nov.），描述了其线粒体基因组结构并阐明了其进化关系。基于以下证据，建议该海蛞蝓属于多角海蛞蝓属（Polybranchia）：（1）基于cox1的系统发育分析显示该物种在多角海蛞蝓属内占据 distinct 分类地位；（2）在线粒体基因组序列上，该物种与其他物种完全分化；（3）形态上与同属物种东方多角海蛞蝓相似，但在关键鉴别特征上存在明显形态差异。东方多角海蛞蝓新形似一团棕色海藻，身体具众多羽毛状cerata，特征为细的、叶脉状分支模式，由多个表现明显色素沉着的颗粒结构组成。印度西南海岸的东方多角海蛞蝓与东方多角海蛞蝓新种在两个关键形态特征上不同：前者cerata呈深绿色，背部具一白色斑点伴轻微肿胀，指示心脏位置。菲律宾的东方多角海蛞蝓可通过以下特征与东方多角海蛞蝓新种区分：心包膜白色且通常非常显眼；cerata柄部凹陷处有雪白色色素；cerata透明，遍布肉桂棕色斑点，伴有两个背中黄色斑块（部分具单黑点）。此外，阐明了东方多角海蛞蝓新种线粒体基因组的结构特征和进化关系。与其他已报道海蛞蝓物种的线粒体基因组在大小和组成上相似，东方多角海蛞蝓新种的线粒体基因组呈环状，总长14,452 bp，包含37个基因（22个tRNA、13个PCGs以及12S和16S rRNA）。整个线粒体基因组及其各个组成部分均呈现高AT含量，且全基因组和PCGs显示AT偏好，与细巧 Thuridilla gracilis、华丽Elysia ornata和角状Elysia cornigera等物种的发现一致，这种AT偏好可能与线粒体DNA复制和转录过程中的进化压力有关。墨西哥多角海蛞蝓（P. mexicana）、东方多角海蛞蝓（P. orientalis）、简氏多角海蛞蝓（P. jannae）等多角海蛞蝓属（Caliphyllidae科）物种缺失于基于13个PCGs的系统发育树，是因为公共数据库中缺乏其完整线粒体基因组序列。目前，已发布的海蛞蝓线粒体基因组信息仍然有限，因此未来研究需要更多线粒体基因组数据，以为阐明其进化历史和遗传分化提供有力支持。该物种属于囊舌目海蛞蝓，因此具有该类群的一些特征。囊舌目通过摄入藻类细胞内容物取食，值得注意的是，这些海蛞蝓从摄食的藻类中隔离活叶绿体并在自身组织内利用它们——这一高度不寻常的现象称为盗食质体（kleptoplasty）。基于叶绿体基因检测和系统发育分析，东方多角海蛞蝓新种很可能具有盗食质体结构，类似于眼斑Plakobranchus ocellatus、绿色Elysia viridis和微小Elysia timida等Plakobranchidae科的物种，这些物种是光合作用海蛞蝓的典型例子。其中，眼斑Plakobranchus ocellatus是一种“太阳能驱动”的海蛞蝓，以其长期保留叶绿体的能力而闻名。收集了东方多角海蛞蝓新种背部区域的cerata，通过特异性PCR和高通量测序检测到叶绿体基因，这些基因与叶状隐甲藻（Kryptoperidinium foliaceum）和沙生舟形藻（Navicula arenaria）的基因高度相似（96.53%），因此有理由假设东方多角海蛞蝓新种可能具有盗食质体能力。拥有盗食质体能力意味着对囊舌目能量获取和生存的重新定义。功能上，它实现了混合营养策略，缓冲了资源稀缺和非生物胁迫；进化上，它驱动了性状分化，有利于宿主基因组适应而非水平基因转移（HGT），并证明复杂性状可通过细胞器隔离获得。从眼斑Plakobranchus ocellatus数月的光合作用到 Placida sp.的短暂能量提升，盗食质体例证了共生“盗窃”如何进化成强大的适应策略——重塑囊舌目内的生态位和进化轨迹。东方多角海蛞蝓新种可能具备盗食质体能力，未来研究应聚焦于实验验证这一非凡特征的存在。

5 结论

综上所述，本文提供的证据证明了在南中国海首次发现东方多角海蛞蝓新种（P. orientalis sp. nov.），该物种以其独特的羽毛状cerata为特征。系统发育分析一致地将其置于Caliphyllidae科的多角海蛞蝓属（Polybranchia）内。我们的发现进一步表明东方多角海蛞蝓新种可能具备盗食质体能力。这些发现不仅扩展了我们对囊舌目海蛞蝓生物多样性的理解，也为盗食质体的进一步研究提供了宝贵基础。