猪德尔塔冠状病毒通过线粒体自噬（mitophagy）降解MAVS抑制I型干扰素应答促进病毒复制的机制研究

本研究揭示了猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染通过诱导线粒体损伤和功能失调，进而激活线粒体自噬（mitophagy），导致线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）降解，从而抑制I型干扰素（IFN-I）产生并促进病毒复制的新机制，为抗冠状病毒治疗提供了新靶点。

　　

1 引言

猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新出现的肠道致病性冠状病毒，感染仔猪并引起严重腹泻，因其跨物种传播潜力而引发重大公共卫生关注。线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是连接病毒识别（RIG-I/MDA5）和干扰素应答的关键免疫枢纽。本研究旨在探讨PDCoV感染是否通过诱导线粒体自噬（mitophagy）影响先天免疫应答。

2 材料与方法

2.1 化学试剂

使用增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、细胞线粒体分离试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒等。抗体包括Tom20、Lamp1、COX-4、GAPDH、SQSTM1/P62、LC3B、MAVS、β-actin、FUNDC1、Parkin、TOLLIP和PDCoV-S蛋白抗体。

2.2 细胞与病毒

使用猪肾上皮细胞系LLC-PK1，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。PDCoV病毒株由华南农业大学惠赠，并在LLC-PK1细胞中增殖。

2.3 流式细胞术

采用JC-1探针评估线粒体膜电位（MMP），使用DCFH-DA染料检测ROS水平，通过流式细胞仪分析荧光强度。

2.4 蛋白质印迹

细胞裂解后提取总蛋白，通过BCA法测定浓度，进行SDS-PAGE分离和PVDF膜转印，使用ECL底物显影并分析蛋白条带。

2.5 RNA提取与实时定量PCR

使用TRIzol试剂提取总RNA，反转录后通过SYBR Green qPCR检测基因表达，以β-actin为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。

2.6 免疫荧光染色

细胞固定、透化后，与一抗和二抗孵育，DAPI染色后通过共聚焦显微镜观察线粒体与自噬体或溶酶体的共定位。

2.7 病毒滴度测定

采用TCID₅₀法测定病毒滴度，使用Reed和Muench法计算。

2.8 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Tukey检验进行组间比较，以P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001和P < 0.0001为显著性标准。

3 结果

3.1 PDCoV感染诱导线粒体损伤

PDCoV感染LLC-PK1细胞后，线粒体膜电位（MMP）随时间推移显著降低，活性氧（ROS）水平升高，线粒体蛋白Tom20和COX-4表达量下降，表明线粒体结构和功能受损，且呈时间和剂量依赖性。

3.2 PDCoV感染诱导线粒体自噬

使用溶酶体酸化抑制剂氯喹（CQ）处理后，PDCoV感染导致的Tom20和COX-4蛋白水平下降得以恢复，而蛋白酶体抑制剂MG132无此效果。PDCoV感染降低p62蛋白水平，增加LC3-II蛋白表达，且线粒体组分中LC3-II水平升高。免疫荧光显示线粒体（Tom20标记）与自噬体（LC3标记）及溶酶体（Lamp1标记）共定位增加，证实PDCoV感染晚期诱导线粒体自噬以清除受损线粒体。

3.3 线粒体自噬抑制IFN-I应答并促进PDCoV复制

使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1或CQ抑制线粒体自噬后，PDCoV S蛋白表达和病毒滴度降低，而IFN-β、IFIT1和ISG15的mRNA表达升高。PDCoV感染导致MAVS蛋白水平下降，而抑制线粒体自噬可恢复MAVS表达。表明PDCoV通过线粒体自噬降解MAVS，抑制IFN-I产生，从而促进病毒复制。

4 讨论

本研究证实PDCoV感染诱导线粒体损伤和功能失调，激活线粒体自噬以清除受损线粒体，同时导致MAVS降解，抑制IFN-I介导的先天免疫应答，促进病毒复制。与SARS-CoV-2 ORF10和PEDV Nsp14的研究结果一致，表明病毒利用线粒体自噬逃逸宿主免疫监视。本研究未明确PDCoV诱导线粒体自噬的具体通路，FUNDC1、TOLLIP和PINK1-Parkin通路均未参与，未来需进一步探究其分子机制。该研究为抗PDCoV治疗提供了新思路，靶向线粒体自噬可能成为控制冠状病毒感染的有效策略。