自噬作用保留：健康老龄化的潜在机制

本研究通过对比健康年轻(23-35岁)与老年(67-93岁)供体CD4+ T细胞的自噬流，发现老年组自噬效率更高，表现为自噬体生物合成减少但降解效率增强。这一发现颠覆了传统认为自噬随年龄衰退的观点，提示自噬功能保留可能是健康老龄化的关键机制。研究采用bafilomycin A1（自噬流抑制剂）和CCCP（线粒体解偶联剂）等精确实验方法，为理解免疫衰老提供了新视角。

　　

自噬作用与健康老龄化的关联机制

ABSTRACT

自噬与保护性细胞过程密切相关，包括线粒体功能、蛋白质稳态和细胞衰老。动物研究表明自噬随衰老出现功能障碍，可能导致T细胞免疫衰老。在人类中，尚不清楚CD4⁺ T细胞的自噬是否随年龄增长而受损。为解答这一问题，研究人员通过一系列实验比较了年轻（23-35岁）和老年（67-93岁）健康供体CD4⁺ T细胞的基础和诱导自噬活性。研究使用免疫荧光检测LC3（自噬体和自溶酶体标记物）和LAMP2（内溶酶体标记物），结合bafilomycin A₁（抑制溶酶体酸化）和CCCP（线粒体解偶联剂）来调控自噬流。研究发现老年供体CD4⁺ T细胞的自噬流显著高于年轻供体，且老年供体中LC3⁺区室数量更多。由于两组自噬体降解总量相当，研究人员得出结论：老年组自噬体生物合成减少。研究结果表明，在健康老年供体中，人CD4⁺ T细胞自噬并未衰退，而是出现代偿性增强，这可能是健康老龄化的机制之一。

引言

衰老常被描述为生物韧性逐渐下降，修复环境压力和熵引起的分子和细胞损伤的能力降低。由此导致的损伤积累损害多种生理系统，包括免疫系统。特别是，T细胞功能障碍与年龄相关疾病有关，如阿尔茨海默病、心血管疾病、糖尿病、感染、自身免疫、癌症和死亡率增加。

典型自噬是一个关键稳态过程，细胞通过将细胞质成分（如蛋白质、细胞器和病原体）隔离在自噬体中，然后与溶酶体融合进行分解和再利用，从而降解和回收这些成分。适当的自噬对于蛋白质稳态、线粒体完整性和细胞衰老的受控调节至关重要。因此，自噬损伤可能通过多种下游效应影响免疫衰老。这在老年阶段尤为重要，因为大分子和细胞器的损伤负担更高。

先前研究表明，老年个体的CD4⁺ T淋巴细胞由于低效的巨自噬（特别是线粒体自噬，即选择性清除受损线粒体，从而允许新线粒体生成）而线粒体健康受损。主要在动物模型中进行的研究表明，自噬随衰老出现功能障碍，这种衰退被认为有助于T细胞免疫衰老。相反，具有 exceptional longevity 的个体及其队列显示出更强大的自噬诱导，但尚未直接评估健康个体自噬随衰老的变化。

先前研究显示，健康个体衰老CD8⁺ T细胞自噬受损，这与更高的DNA损伤相关。促进自噬的代谢物亚精胺在人类CD8⁺ T细胞中随年龄减少，补充亚精胺可恢复活化CD8⁺ T细胞的自噬。然而，这些发现可能不直接适用于CD4⁺ T细胞，因为衰老过程中的代谢、表型和功能变化在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中存在显著差异。尽管组学（转录组学和蛋白质组学）报告了多种人类细胞（包括CD4⁺ T细胞）中自噬组分的表达，但自噬的功能状态只能通过直接分析自噬区室的生物合成和降解来确定，这被描述为自噬流。有限的研究探讨了人类CD4⁺ T细胞自噬是否随年龄下降，尤其是在健康步入老年的个体中。值得注意的是，尚未有直接研究比较健康年轻和老年个体CD4⁺ T细胞的自噬，使得自噬是否在CD4⁺ T细胞中随年龄下降的问题悬而未决。解决这一问题很重要，因为自噬对于维持淋巴细胞功能至关重要，自噬缺陷可能有助于免疫衰老。

在本研究中，研究人员调查了无慢性疾病的年轻和老年个体CD4⁺ T细胞的自噬。基于先前小鼠研究，假设老年参与者CD4⁺ T细胞自噬低于年轻参与者。相反，研究结果表明，健康供体CD4⁺ T细胞自噬随衰老而保留，通过增加自噬效率维持。这一观察指出了应在未来研究中探索的适应性机制。

结果

基础自噬活性

为分析年轻和老年健康供体CD4⁺ T细胞自噬的基础状态，研究人员进行了免疫染色并评估了微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）阳性区室（自噬体和自溶酶体）的数量。在稳态条件下，基础LC3⁺斑点数量在老年（年龄范围67-93岁）供体细胞中倾向于低于年轻（年龄范围28-35岁）供体，尽管差异无统计学显著性。斑点数量减少似乎并非由于老年供体细胞中这些区室的更高聚类，因为考虑LC3⁺区室占据的细胞面积分数时观察到相似趋势。显著地，这种老年供体CD4⁺ T细胞基础LC3较低的趋势在九个实验对中的八个中一致发现。

相比之下，两组中由溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）阳性区室指示的内溶酶体平均数量相似。此外，总LC3⁺囊泡（自噬空泡）中为自溶酶体（定义为LC3和LAMP2共定位区室）的百分比在两组间也可比。

为理解老年组基线较低LC3斑点数量是自噬体生物合成减少（自噬诱导降低）还是自噬体清除增加（降解）或两者兼有的结果，研究人员接下来分析了bafilomycin A₁处理后LC3斑点/细胞数量和面积/细胞的变化。Bafilomycin A₁抑制溶酶体中的质子泵，阻止溶酶体酶活性所需的酸化，从而导致LC3斑点积累。Bafilomycin A₁处理后，发现年轻和老年个体CD4⁺ T细胞间LC3斑点/细胞无显著差异。处理前后LC3斑点或LC3面积/细胞的比率（自噬流）显示，老年供体CD4⁺ T细胞的自噬流显著高于年轻供体，无论是斑点/细胞还是面积/细胞。支持这些发现的稳健性，在从一对老年和年轻个体收集的细胞进行的八个实验中，老年个体细胞的自噬流均高于年轻个体。仅在一个实验中（其中一个老年个体与两个年轻个体比较）未得到此结果。

由于用或不用bafilomycin A₁处理的细胞中LC3⁺斑点的比率主要告知系统效率（有效流），但不一定是每种条件下降解的自噬区室量的可能变化，研究人员还计算了净流作为bafilomycin A₁处理后和处理前LC3斑点/细胞的差值。发现考虑斑点总体数量时，老年参与者CD4⁺ T细胞的净流与年轻参与者无显著差异，或分析bafilomycin A₁诱导的LC3⁺面积/细胞变化时也是如此。这些发现表明，尽管老年组CD4⁺ T细胞中自噬体被溶酶体更有效地分解（通过更高LC3流证明），但相同时间段内降解的自噬体总量相似（显示可比的净LC3流）。进一步支持这些结果，老年组显示较低的稳态LC3斑点数量。这些发现与老年组自噬体生物合成较低一致，但溶酶体降解未随年龄增长而恶化。与此观点一致，发现老年组与年轻组相比，共定位LC3-LAMP2斑点/细胞（自溶酶体）分数可比，再次表明两个年龄组自噬体向自溶酶体成熟效率相似。

作为侧面观察，研究人员利用bafilomycin A₁处理也探究了溶酶体区室的稳定性，因为溶酶体膜完整性已被显示在某些生物体中随年龄下降。LAMP2是一个具有长半衰期（>2天）的完整溶酶体组分，因此其降解在实验时间内应不可察觉，除非存在溶酶体破裂和随后溶酶体酶释放。正如预期，年轻组CD4⁺ T细胞中LAMP2降解可忽略不计。在老年供体组中，虽然总体LAMP2降解与年轻组无显著差异，但发现更高的异质性，九个样本中有四个显示LAMP2降解增加。有趣的是，尽管CD4⁺ T细胞中溶酶体稳定性可能随年龄有些降低，但其自噬效率（降解自噬体的能力）仍然良好保留。

研究人员进行了敏感性分析以确定（1）移除实验1（包括分析93岁男性数据作为异常值）是否会导致bafilomycin A₁处理后诱导自噬流结果的有意义变化，以及（2）移除实验1和7（包括同一实验中男性和女性数据）是否会导致诱导自噬流结果的有意义变化。移除实验1显示，尽管通过线性混合效应分析不再显著，但老年组自噬流仍高于年轻组。七个实验中有七个年龄效应一致性保持统计学显著。移除包括男性和女性的实验（实验1和7）后，老年组相比年轻组更高的自噬流仍然统计学显著。

诱导自噬活性

在年轻和老年供体CD4⁺ T细胞中观察到的基础自噬/溶酶体功能的相当稳健性促使研究人员研究自噬系统如何在不同年龄响应应激。为此，使用了线粒体解偶联剂羰基氰化物m-氯苯腙（CCCP），通过诱导能量应激刺激自噬（优先线粒体自噬）。添加CCCP导致老年年龄组稳态LC3阳性区室数量总体增加，而年轻组未观察到，尽管差异无统计学显著性；代表性图像和LC3斑点/细胞如图所示。先前观察到的老年供体CD4⁺ T细胞相比年轻供体CD4⁺ T细胞LC3阳性斑点数量较低不再明显。分析CCCP对每个年龄组LC3的影响显示，老年组LC3斑点数量增加显著更高。未观察到添加CCCP对内溶酶体区室（LAMP2阳性）数量的实质性变化，除了两个老年和一个年轻供体样本显示2倍增加。

老年供体样本在CCCP处理后观察到的相对较高LC3区室增加可能是自噬更高诱导或自噬体清除减少的结果。为区分这两种可能性，研究人员分析了添加CCCP到bafilomycin A₁处理细胞后的自噬流。与文献报道的临床前研究相反，CCCP添加并未一致增加所有供体样本的自噬流，无论年龄。实际上，自噬流和净自噬流在CCCP诱导后在两个年龄组均显著降低。图显示每个实验中不同个体在添加CCCP和/或bafilomycin A₁后总体LC3斑点变化：仅在一个年轻供体样本（实验5中35岁[Y2]）中观察到CCCP下LC3降解高于基础条件（bafilomycin A₁ + CCCP与bafilomycin A₁相比），而所有其余样本显示一致的CCCP诱导LC3降解降低。有趣的是，混合效应分析显示，添加CCCP完全消除了基础条件下老年组CD4⁺ T细胞中观察到的更高LC3流。净LC3流分析显示，尽管CCCP处理后总是较低，但两个年龄组间CCCP添加后经历溶酶体降解的自噬体总量无差异。CCCP本身添加未加重溶酶体不稳定性（LAMP2降解）。

总体而言，研究结果支持健康个体CD4⁺ T细胞基础条件下自噬活性无重大损害，但响应CCCP应激源时维持自噬活性的能力较低，尽管微小。

讨论

许多研究（主要在动物中）表明自噬随生物体衰老效果降低。在动物模型（如秀丽隐杆线虫、啮齿动物）和一些人类细胞中的研究显示年龄依赖性蛋白水解溶酶体功能下降，损害自噬流，似乎与年龄相关疾病有关。自噬在衰老过程中的假设作用也得到自噬相关基因的药理和遗传操作支持，显示实验动物模型中的组织特异性功能变化和/或一致寿命延长或缩短。

尚不清楚自噬的相同下降是否发生在衰老人类中，特别是那些在晚年保持健康和相对活跃的个体。在这项涉及健康老年人的研究中，研究人员评估了从健康年轻和老年个体对收集的CD4⁺ T细胞的自噬参数。与假设相反，发现健康供体CD4⁺ T细胞自噬不随衰老下降，并显示一些代偿性增强迹象。令人惊讶的是，这些细胞清除自噬体的效率在老年供体中显著高于年轻供体。有趣的是，虽然老年供体样本自噬体清除率更高，但降解的自噬体总体粗量相当。由于这些变化与给定时间成熟为自溶酶体的自噬空泡百分比变化无关，研究人员得出结论：老年组自噬体生物合成减少。这一发现可解释为维持自噬的特定代偿机制，尽管至少理论上这种策略可能使老年人更易受到需要全功能自噬的明显应激挑战。虽然先前研究指出自噬随年龄下降，但发现健康老年个体在CD4⁺ T细胞中维持有效的自噬过程。观察到的避免自噬体积累的代偿机制类似于先前在一些啮齿动物器官中随年龄描述的情况。

研究未发现年轻和老年供体CD4⁺ T细胞溶酶体稳定性存在明显差异，但存在朝向老年供体细胞异常LAMP2降解的趋势。这可能连同尚未探索的溶酶体pH或酶含量差异，触发观察到的自噬体生物合成减少，以减少货物递送到功能较差的溶酶体。预计成功引发这种适应机制的细胞将更长时间保持功能。一个紧迫问题是，这些无慢性疾病的健康个体中有效自噬的保留是否是其健康状态维持的原因之一。这一假设应在未来研究中测试，比较相同年龄范围内健康与虚弱个体自噬和内溶酶体系统状态。

研究中引入CCCP的初衷是比较基础和诱导自噬，因为CCCP已证明在不同实验模型中有效上调自噬。出乎意料地，发现CCCP对年轻和老年个体CD4⁺ T细胞自噬流有抑制作用。实验动物模型优化浓度可能导致人类细胞过度线粒体去极化，导致能量受损细胞无法维持适当的自噬功能。此外，尽管CCCP通常被报道诱导自噬，但也有报道在某些条件下抑制自噬。研究人员使用CCCP暴露后收集的数据分析自噬系统稳健性和响应此应激的能力。CCCP挑战揭示了老年组相比年轻组自噬溶酶体系统的略高脆弱性。老年组初始较低自噬体数量在CCCP后不再明显，可能由于老年参与者细胞净自噬体降解较低。

早期在啮齿动物和其他动物模型中的工作表明自噬随衰老下降。然而，最近发现小鼠脂肪细胞中存在年龄相关自噬流增加。也发现糖尿病患者外周血单核细胞（PBMCs）自噬流随年龄增加。近期证据支持在人类研究中关注细胞和组织特异性及疾病状态的重要性，在检查动物模型自噬作为研究人类自噬过程（特别是与年龄相关的）替代时应谨慎。

文献中有明确物种差异的证据，选择性压力可能影响长寿物种自噬效率的保存。自噬缺陷个体可能经历过早死亡或受慢性疾病影响，从而阻止他们参与研究。事实上，主要通过小鼠模型发现自噬失调与人类许多疾病/障碍有关，包括神经退行性、心血管、肺、肝、肾和肿瘤疾病。与自噬扰动的特定疾病关系已在Klionsky, Petroni等人中广泛综述。相反，药理学治疗，包括亚精胺、白藜芦醇、尿石素A和番茄碱在动物模型（如秀丽隐杆线虫、果蝇和小鼠）中已显示通过激活自噬延长动物寿命和健康寿命。

从进化角度，蝙蝠显示证据表明与其他哺乳动物相比自噬随年龄增加。在8年纵向分析中，使用转录组学分析显示长寿蝙蝠物种随年龄增长自噬转录程序上调。蝙蝠是体型最长寿的哺乳动物，该组发现10个自噬相关基因在蝙蝠谱系中受选择压力。蝙蝠总体具有最大长寿商数，与另一种长寿物种（就其体型而言）裸鼹鼠相似，其中随年龄保留的自噬活性也有报道。

研究结果表明，在筛查为健康的参与者中，CD4⁺ T细胞自噬流随年龄增加。这可能表明自噬过程随时间适应以支持长寿哺乳动物生存，特别是在那些保持健康直至晚年的个体中。随着损伤随衰老积累，身体可能需要增强自噬以应对这种增加的应激。因此，尽管损伤积累，基础自噬较低的发现本身可能是缺陷的标志。当自噬被刺激时，老年人中的更大增加可能是需要处理的损伤材料量更大的结果。因此，随着更多损伤在老年积累，可以预期维持稳态所需的自噬流需要更高。此处研究的老年个体可能因其保守的自噬而仍然健康，因此自噬流可能潜在地发展为健康衰老的生物标志物，或在CD4⁺ T细胞特定背景下，免疫适应性的生物标志物。

由于老年个体细胞分子损伤积累可能高于年轻个体细胞，可以推测自噬体生物合成增强可能有益于维持健康状态，只要伴随溶酶体系统改善，最终将负责降解那些自噬体。最近概述了自噬体生物合成和功能所涉及的机制。自噬核心复合物的关键和可能改善自噬体生物合成的操作靶点包括ULK1复合物（通过机制靶点雷帕霉素抑制激活，也通过饥饿、缺氧、内质网应激）、III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-III）复合物和BECN1/Beclin 1（调节亚基，受内质网应激、缺氧、微生物感染刺激）。特别是，BECN1是PI3K-III复合物的核心组分，通过调节PI3K-III催化单元VPS34的脂质激酶活性（产生磷脂酰肌醇3-磷酸[PI(3)P]），允许招募许多参与自噬体成核的自噬蛋白。在小鼠中，Beclin 1过表达已显示刺激自噬，也显示对几种疾病模型（如3型脊髓小脑性共济失调）有保护作用。BECN1衍生物Tat-BECN1已证明在给小鼠腹腔注射后诱导心脏、骨骼肌和胰腺自噬。许多小鼠细胞（包括CD8⁺ T细胞）和许多人类细胞类型（包括CD4⁺ T细胞）已显示对Tat-BECN1/Beclin 1有响应。事实上，破坏Beclin 1与负调节因子BCL-2相互作用的Becn1突变延长小鼠健康寿命和寿命，并增加基础自噬。

然而，任何增加自噬体生物合成的尝试，要成功，应伴随努力改善溶酶体系统质量/功能。在这方面，已证明增加自噬体和溶酶体生物合成的干预措施，如激活转录因子TFEB，可能证明在保留自噬流方面有效。

研究结果也指向增加自噬和自噬流可能的健康保护益处。许多小鼠和大鼠研究及一些人类研究显示热量限制增加器官和组织（如肝、肌肉、脂肪和肾）自噬和自噬流。热量限制模拟物（CRMs）如二甲双胍（AMPK激活剂）、雷帕霉素（mTOR抑制剂）和亚精胺（通过抑制乙酰转移酶作用）各自已知增加自噬并对免疫韧性有影响。二甲双胍已显示影响免疫介导细胞（如CD4⁺和CD8⁺ T细胞）分化和激活，并已显示通过增强自噬和正常化线粒体功能改善Th17炎症衰老特征。关于雷帕霉素相关免疫效应，一项随机安慰剂对照2a期临床试验显示，低剂量组合催化（BEZ235）加变构（RAD0001）mTOR抑制剂（选择性抑制TORC1）在1年后报告感染率显著降低。亚精胺已显示对免疫细胞有多种影响，能够通过自噬翻译控制逆转免疫衰老，最常通过影响溶酶体和通过TFEB表达（优先影响溶酶体生物合成）实现。

这些自噬适应机制需要在健康和