小鼠骨间充质谱系细胞单细胞RNA测序揭示衰老景观及其分子机制

本文通过单细胞RNA测序技术系统描绘了小鼠骨内膜和骨外膜间充质细胞在衰老过程中的转录组变化，揭示了雌雄个体在骨衰老中的显著差异。研究发现雌性小鼠骨内膜前成骨细胞和成骨细胞表现出最显著的衰老相关变化，包括细胞外基质（ECM）产生减少、自噬（autophagy）功能下降、细胞衰老（senescence）增加等。特别值得注意的是，研究通过对比Atg7f/f; Osx1-Cre基因敲除小鼠模型，首次证实自噬缺陷与成骨细胞衰老之间存在因果关系。这些发现为理解骨质疏松症（osteoporosis）的分子机制提供了重要见解。

　　

摘要

骨形成减少和成骨细胞数量下降是年龄相关性骨质疏松症的重要致病因素。然而，衰老对成骨细胞前体、成骨细胞、骨细胞及其他骨间充质细胞类型的分子机制尚不清楚。本研究通过对年轻和年老C57BL/6小鼠骨内膜和骨外膜间充质细胞进行单细胞RNA测序，发现雌性小鼠骨内膜的前成骨细胞和成骨细胞在衰老过程中变化最为显著。转录组变化显示基质蛋白产生和自噬功能下降，而衰老、磷酸化和缺氧反应增加。由于成骨细胞谱系细胞中的巨自噬缺陷会降低骨形成，研究人员对比了Atg7^f/f; Osx1-Cre小鼠自噬失活与自然衰老引起的转录变化，发现自噬缺陷与成骨细胞衰老之间存在因果关系。

1 引言

衰老是骨质疏松和骨折的最大风险因素。随着年龄增长，骨骼发生微结构变化，包括骨小梁丢失、骨内膜表面骨丢失导致的骨髓腔扩大以及骨外膜骨形成引起的外表面扩大。在整个骨骼系统中，成骨细胞数量随年龄增长而减少，而在某些骨骼部位（如长骨骨内膜表面）破骨细胞数量增加。

人类雌雄个体骨骼衰老存在显著差异，女性比男性丢失更多骨量，这部分归因于绝经后雌激素的丧失。尽管雌性小鼠不经历绝经期，但其骨骼也存在类似的性别差异。多种机制被认为参与健康寿命的衰退，其中许多机制在多种组织衰退中发挥作用。

2 方法

2.1 动物饲养与护理

野生型C57BL/6J小鼠来自NIA啮齿类动物衰老种群。Atg7^f/f; Osx1-Cre小鼠通过将Atg7^f/+与Osx1-Cre小鼠杂交获得。

2.2 细胞分离

分别从骨膜或骨内膜和骨小梁中制备细胞，每组使用2-4只小鼠。通过系列消化步骤分离骨内膜和骨外膜细胞，并使用谱系耗竭试剂盒进一步富集间充质细胞。

2.3 10X基因组学测序

使用Chromium Controller（10X Genomics）封装单细胞，使用Chromium Single Cell 3′试剂盒（10X Genomics）构建文库，使用Illumina NovaSeq 6000机器对文库进行测序。

2.4 单细胞RNA测序的生物信息学分析

使用Cell Ranger软件版本7.1（10X Genomics）预处理fastq文件，使用Seurat软件包版本4.2.0进行进一步分析。使用基于前50个主成分和6000个最可变特征的相互主成分分析方法进行样本间协调。使用Louvain算法进行聚类，使用UMAP进行降维。

2.5 原位杂交

使用RNAscope技术进行原位杂交，检测Limch1、Cdkn2a、Angpt4和Postn等基因的表达。

3 结果

3.1 通过scRNA-Seq构建衰老小鼠骨间充质细胞图谱

为了研究衰老对骨间充质细胞转录变化的影响，研究人员从6月龄和24月龄C57BL/6J小鼠中分离细胞，分别分离骨内膜与骨外膜细胞。分离的细胞通过去除造血和内皮细胞进行间充质细胞富集，并使用10X Chromium平台进行scRNA-seq。

3.2 骨内膜表面前成骨细胞比例不随衰老而减少

聚类分析揭示了骨内膜主要间充质细胞类型的 distinct 簇。年轻和年老小鼠骨内膜样本中最丰富的细胞类型是成骨细胞、前成骨细胞、骨-CAR细胞和脂肪-CAR细胞。在两性中，成骨细胞的丰度随年龄增长而显著降低，这与之前的组织形态计量学发现一致。出乎意料的是，前成骨细胞的比例随衰老而一致增加，表明这些细胞的分化受损或促进其分化的因子随衰老而减少。

3.3 衰老降低成骨细胞基因特征和成骨细胞分化通路

基因集富集分析显示，许多与成骨细胞表型相关的基因本体术语在衰老小鼠中下调。成骨细胞分化标志物如Bglap、Bglap2、Car3、Col1a1和Col1a2的表达降低，其他细胞外基质基因如Coll11a1、Sparc、Lum、Dcn和Fbn2也降低。相反，其他ECM基因如Spp1、Lamc3、Thbs2和Thbs4随衰老而增加。Wnt和BMP信号通路中几个抑制剂随衰老而增加，特别是在雌性中，这可能有助于成骨细胞减少和前成骨细胞积累。

3.4 老年小鼠骨内膜细胞表现出细胞衰老和炎症反应标志物

细胞衰老是响应压力或损伤触发的过程，其特征是稳定的细胞周期停滞和多种细胞内表型变化。构建的衰老相关GO术语显示，衰老小鼠细胞中与炎症反应和衰老相关的生物过程增加。前成骨细胞和成骨细胞表现出最显著的衰老相关基因增加，包括Cdkn2a、Ccnd1、Ccn2、Mmp13、Serpine2、Spp1、Mif、Timp2和Tgfb1。表达Cdkn2a的细胞比例在前成骨细胞和成骨细胞中增加3-4倍。

3.5 衰老影响细胞代谢并上调雌性前成骨细胞和成骨细胞的缺氧反应

分析显示，衰老特别是雌性小鼠中，与营养感知、代谢和线粒体功能障碍相关的基因表达模式失调。前成骨细胞和成骨细胞对过氧化氢（H₂O₂）的细胞反应增加，同时质子驱动力驱动的线粒体ATP合成相关基因表达降低。雌性小鼠的前成骨细胞和成骨细胞还表现出对氨基酸饥饿、缺氧、血管生成和铁离子运输的反应上调。

3.6 衰老增加转录和磷酸化同时降低蛋白质稳态

比较转录组结果还表明，老年雌性小鼠的前成骨细胞和成骨细胞中与转录相关的生物过程增加。许多参与应激反应的转录因子表达上调。蛋白磷酸化GO术语在前成骨细胞和成骨细胞中强烈增加。蛋白质印迹分析显示，老年小鼠样本中p38和Akt的磷酸化显著增加。与翻译相关的大量核糖体蛋白亚基编码基因在两性小鼠细胞中表达上调。

3.7 自噬减弱促进间充质谱系细胞衰老

研究结果迄今表明，成骨细胞谱系细胞表现出许多不同衰老机制的标志物，包括巨自噬下降。研究人员分析了3月龄雄性Atg7^f/f; Osx1-Cre小鼠骨内膜细胞中仅由自噬缺陷引起的转录组变化。Atg7缺陷小鼠中成骨细胞比例显著降低，而骨-X细胞比例增加。自噬缺陷增加了与翻译、衰老和血管生成相关的基因表达。

3.8 骨膜中骨-X细胞比例随衰老减少与应激反应基因增加相关

骨膜是覆盖骨外表面的纤维组织，含有对骨折愈合不可或缺的干细胞和祖细胞群。骨膜中的几个成纤维细胞簇代表了大多数细胞，即骨-X细胞、成纤维-1细胞、成纤维-2细胞和肌腱细胞。在两性中，骨-X细胞的比例随衰老而降低。基因集富集分析显示，与骨骼发育、胶原产生和BMP反应相关的生物过程在大多数骨膜细胞簇中随衰老而减少。

4 讨论

本研究全面描述了这些不同间充质细胞类型中发生的与衰老相关的转录变化。前成骨细胞和成骨细胞表现出最显著的转录变化是一个意外的发现，特别是与骨细胞等长寿命细胞相比。研究发现揭示了男女性别衰老转录组之间以及骨内膜与骨外膜细胞之间的意外差异。

一个新颖的发现是，衰老小鼠中前成骨细胞比例增加，这与当前关于骨骼干细胞衰老和成骨细胞祖细胞减少导致骨形成减少和骨丢失的范式形成对比。研究表明，老年小鼠中前成骨细胞的数量并不受限，但它们向成骨细胞的分化可能受损。

另一个新颖的发现是，雌性小鼠骨内膜前成骨细胞和成骨细胞中与年龄相关的基因表达变化远大于雄性。骨骼衰老的一个主要性别差异是皮质骨孔隙度的发育，这主要在雌性中观察到。皮质骨孔隙度是由过度和不平衡的骨重塑引起的，可能导致老年女性人群的高骨脆性。

5 研究局限性

这些研究有几个局限性，包括scRNAseq对低表达转录本的敏感性不足，以及每个分析中代表的小鼠数量较少。然而，在整个手稿中，研究人员强调了单细胞结果证实了使用其他实验方法观察到的与年龄相关的变化的情况。