巨噬细胞源细胞外囊泡伪装AIEgen/IDO1抑制剂纳米平台通过多维度重编程肿瘤微环境实现光热免疫治疗以激活“免疫热”肿瘤

本文推荐一篇创新性研究，该工作构建了巨噬细胞来源的细胞外囊泡（EVs）伪装的纳米平台（A/I@REHM），负载聚集诱导发光光热剂（AIEgen）AXCB6和IDO1抑制剂NLG919。该平台通过近红外（NIR）激光触发光热治疗（PTT）诱导免疫原性细胞死亡（ICD），同时利用NLG919逆转色氨酸（Trp）代谢免疫抑制，并借助工程化M1-EVs重编程肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），形成“PTT物理消融—复极化重塑肿瘤微环境（TME）—免疫检查点干预”的三叉戟式协同疗法，成功将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，为实体瘤免疫治疗提供了新策略。

　　

1 引言

免疫治疗已成为延长癌症缓解期的最有效和最有前景的策略之一，其通过激活和利用免疫系统来识别和消除癌细胞。免疫检查点阻断（ICB）特别是通过破坏抑制性免疫检查点（如PD-1、PD-L1、CTLA-4、4-1BB和IDO1）来促进抗肿瘤 immunity。然而，肿瘤微环境（TME）中免疫抑制网络的复杂性限制了ICB仅对一部分患者有效。核心机制涉及肿瘤劫持免疫检查点以强制免疫耐受，例如IDO1的过表达。该酶驱动色氨酸（Trp）-犬尿氨酸（Kyn）代谢轴，发挥双重免疫抑制作用：Trp耗竭直接损害效应T细胞功能，而Kyn积累促进调节性T细胞（Treg）扩增。这些协调机制通过抑制效应T细胞和扩增免疫抑制性Tregs来建立免疫特权生态位。尽管小分子IDO1抑制剂（如NLG919）可阻断酶活性并增强ICB疗效，但单一疗法难以克服抗原性差、T细胞耗竭的“冷”肿瘤的多维免疫逃逸。因此，通过增强T细胞浸润将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤对于改善ICB治疗结果至关重要。

近年来提高ICB疗效的进展集中在通过促进肿瘤抗原释放、激活抗原呈递细胞和增强T细胞浸润来重建抗肿瘤免疫循环。化疗、光动力治疗（PDT）和光热治疗（PTT）等策略可诱导ICD，释放损伤相关分子模式（DAMPs），如表面钙网蛋白（CRT）、细胞外HMGB1和ATP，从而增强肿瘤免疫原性。这些信号级联募集和成熟淋巴结中的树突状细胞（DCs），使得细胞毒性T淋巴细胞（CTL）激活和系统性免疫反应。其中，PTT利用在近红外（NIR）窗口（780–1350 nm）具有强吸收的光热剂。在NIR光照射下，这些试剂通过非辐射弛豫过程将光子能量转化为热量，产生局部高温用于肿瘤消融。与PDT和化疗相比，PTT具有优异的组织特异性，避免多药耐药，且不依赖于氧气水平。然而，PTT后的残留肿瘤常引发炎症风暴，募集促肿瘤免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），促进免疫抑制和复发。为了解决这个问题，复极化剂可以重编程TAMs向抗肿瘤表型转变，与IDO1阻断协同对抗T细胞耗竭。因此，整合“PTT诱导的原发肿瘤消融、TME复极化和免疫检查点干预”建立了一种三管齐下的策略，以消除局部免疫抑制屏障，抑制转移前微环境，并放大系统性抗肿瘤 immunity，为根除原发肿瘤和播散性转移提供了变革性范式。

为实现安全高效的三位一体协同治疗，我们策略性地选择了AIE分子用于PTT。与传统的光热剂（如ICG和金纳米棒）因聚集导致猝灭效应而受限不同，AIE分子不仅在聚集状态下表现出更高的光热转换效率，还能在手术过程中实现实时NIR和热成像。不幸的是，这个有前景的解决方案带来了新的障碍：AIE光热剂（AIEgens）固有的水溶性差。这一限制恰好与NLG919面临的药学障碍相似，NLG919是一种有效的咪唑吲哚衍生物和IDO1抑制剂，目前正处于临床试验阶段，由于其疏水性同样需要高剂量。为了同时解决这两个溶解度挑战，中空介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSN）成为一个优化的递送平台，受益于其可调的孔结构和卓越的药物负载能力。然而，其开放的介孔通道容易导致药物不受控的泄漏，迫使研究人员采用化学修饰来提高性能。传统的修饰策略却陷入了“功能-安全”的恶性循环：尽管表面电荷修饰、PEG化和功能化各自已经改善了性能，但分别面临着如蛋白质冠形成、免疫排斥和苛刻反应条件导致结构变形等挑战。这些困境表明，基于化学修饰的“功能叠加”范式难以协调分子-载体-生物界面上的多重矛盾，迫切需要新策略来重建材料-生物界面。

受巨噬细胞通过内吞-外排途径选择性包装和分泌物质负载的EVs的自然生物机制启发，我们开发了一种创新的基于巨噬细胞的生物反应器系统。如Scheme 1A所示，我们创新性地使用巨噬细胞作为生物反应器：首先，用负载AIEgen AXCB6和IDO1抑制剂NLG919的HMSN刺激巨噬细胞极化，然后分离工程化的巨噬细胞EVs，并进一步用环状Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys（RGD）肽修饰以增强靶向能力。与传统的依赖于苛刻物理或化学处理的EVs功能化技术不同，纳米材料辅助的细胞生物反应器策略成功地保留了M1-EVs的复极化特性，并完全保持了药物的固有性质。如Scheme 1B所示，工程化的A/I@REHM通过血液循环并外渗到“冷”肿瘤中并最终积聚。表面修饰的RGD靶向肿瘤细胞上过表达的α_vβ₃受体，A/I@REHM被内化到细胞中。内吞后，A/I@REHM成功从溶酶体中逃逸。在NIR激光照射下，AXCB6和NLG919在细胞内释放：AXCB6通过PTT直接杀死肿瘤细胞并诱导ICD，触发DAMPs的释放，从而诱导针对肿瘤的原位疫苗反应；激活的信号梯度级联驱动DCs的募集和成熟以及抗原向细胞毒性T细胞的呈递，最终激活系统性免疫反应。同时，NLG919有效抑制PTT响应下过表达的IDO1活性，逆转了Trp代谢介导的免疫抑制，触发Tregs的耗竭，并促进效应T细胞的增殖。此外，分布在“冷”肿瘤中的巨噬细胞被进一步复极化为M1表型，这也增强了效应T细胞的增殖。这种“PTT物理消融—复极化重塑TME—免疫检查点干预”的三方协同，如同波塞冬的三叉戟，成功地将TME从“冷”肿瘤逆转为“热”肿瘤，实现了安全高效的抗肿瘤效果。

2 结果与讨论

2.1 A/I@REHM的表征

HMSN由于其径向有序的多孔和中空结构而具有优异的疏水性药物负载性能。然而，互连的介孔材料可能导致药物泄漏问题，这促使研究人员采用化学修饰方法来改善其性能。值得注意的是，传统的修饰策略常常陷入“功能-安全”的恶性循环。为了解决这个限制，我们开发了一种HMSN引导的细胞生物反应器技术，实现了工程化EVs的无损原位合成。纳米材料工程化的EVs表现出出色的生物相容性、优异的渗透能力和主动靶向能力，同时具有低免疫原性，显示出作为癌症治疗纳米载体的巨大潜力。如图1A所示，首先使用原硅酸四乙酯和十六烷基三甲基氯化铵获得可生物降解的HMSN纳米颗粒。随后，将疏水性药物NLG919和AXCB6共同负载到HMSN中，实现了NLG919 23.1%和AXCB6 14.3%的药物负载量，成功构建了A/I@HM。接下来，使用A/I@HM刺激M0 RAW264.7向M1表型极化。形态学观察显示，RAW264.7与A/I@HM共孵育后出现显著的伪足。流式细胞术分析显示CD86⁺细胞群增加，这证实了A/I@HM处理和LPS刺激都可以将M0 RAW264.7极化为M1表型。此外，实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-6和TNF-α mRNA表达水平进一步证实了M1表型的形成。与RAW264.7共孵育24小时后，从上清液中分离出EVs。随后，用RGD修饰囊泡表面以增强靶向能力，最终成功构建了负载NLG919和AXCB6的HMSN包被的EVs系统A/I@REHM。负载能力结果证实，封装在其中的NLG919和AXCB6在该系统中没有丢失。

此外，对来自A/I@HM处理的巨噬细胞的EVs进行了表征。如图1B,C所示，未封装的A/I@HM纳米颗粒呈现中空结构且表面不均匀，平均粒径为224.3 nm，表明合成的纳米颗粒可能形成了HMSN。相比之下，A/I@REHM呈现杯状结构，平均粒径增加至232.1 nm。这种现象表明A/I@HM已被EVs成功封装，粒径的增加正是由于EVs的封装。蛋白质印迹分析（图1D）显示，在EVs和EVs封装的A/I@HM中均检测到CD63、CD9和Alix的条带，进一步证实了A/I@HM被EVs工程化。为了验证EVs对HMSN的封装，我们分别用异硫氰酸荧光素（FITC）和Did标记HMSN和RGD表面偶联的EVs（REVs）。共聚焦图像（图1E,F）显示FITC标记的HMSN和Did标记的膜存在共定位，进一步证明我们成功构建了HMSN引导的巨噬细胞生物反应器，实现了工程化EVs的无损原位合成。UV-Vis光谱结果表明，A/I@REHM在229 nm和820 nm处分别显示出NLG919和AXCB6的特征峰，证实了成功负载。在808 nm激光照射下，A/I@REHM在1064 nm处显示出明显的发射峰，表明具有NIR-II成像的潜力。值得注意的是，A/I@REHM中AXCB6的发射光谱与AXCB6在THF溶液中的特征发射峰完全一致，进一步证实了AXCB6的成功负载。结果表明，这种巨噬细胞生物工程化的EVs伪装的多功能纳米平台不仅保留了M1-EVs的复极化特性，而且成功保持了NLG919和AXCB6在生物孵育过程中的负载稳定性，确保了药物的固有性质不受影响。

2.2 细胞和多细胞肿瘤球体摄取的评估

纳米颗粒药物递送系统的治疗效果关键取决于其细胞摄取效率，这是控制药物在TME内渗透和滞留的关键因素。为了系统评估这一参数，我们在PAN02细胞中对两种FITC标记的纳米颗粒制剂（FITC@HM和FITC@REHM）进行了比较研究。值得注意的是，FITC@REHM显示出比FITC@HM高1.74倍的细胞摄取率（50.42%对28.96%），这可能归因于REHM保留了天然EVs的信号特性，有利于细胞识别和内化。基于这些发现，我们的时间过程分析揭示了FITC@REHM的快速且高效的摄取动力学。在1小时内，51.7%的FITC@REHM被膜吸附，到6小时时进展到88.98%的内化，表明EV模拟伪装显著增强了细胞摄取的速度和程度——这是治疗效果的关键因素。

为了进一步研究肿瘤渗透能力，我们在PAN02多细胞肿瘤球体（MCTs）中使用了共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行Z-栈成像，该模型忠实地再现了TME的关键特征。两种制剂之间出现了显著差异：虽然FITC@HM主要停留在外周且渗透有限，但FITC@REHM实现了深度的球体浸润，证据是在整个MCTs结构中显示出强而均匀的荧光。使用我们新颖的指标——分布指数（DI）、滞留指数（RI）和迁移指数（MI）进行的定量评估提供了机制上的见解。FITC@REHM在所有参数上均显示出显著增强的值，证明了优异的药物分布、滞留和扩散能力。这些优势源于EV包被的HMSN固有的药物转运特性，结合了合成纳米颗粒和天然EV运输机制的优点。

我们的研究结果表明，M1巨噬细胞来源的EVs伪装递送系统通过维持EVs信号有效增强细胞摄取，加速内化动力学，并实现深度肿瘤渗透。这些联合效应协同提高了瘤内药物浓度，改善了治疗效果。

2.3 NIR激光下A/I@REHM光热效应的评估

AIEgen AXCB6具有强吸电子苯并双噻二唑核心、噻吩π桥和末端三苯胺供体。强供体单元内存在多个转子结构促进了分子内电荷转移（ICT）并打开了非辐射衰变途径，从而实现了由NIR-II荧光引导的高效光热治疗。NIR吸收特性分析表明，AXCB6在NIR-I区808 nm处有强吸收，在NIR-II区1100 nm处有最大发射波长。密度泛函理论计算揭示了分子轨道特性：最高占据分子轨道（HOMO）的波函数集中在缺电子核心上，而最低未占分子轨道（LUMO）的波函数沿着分子骨架离域。AXCB6的HOMO和LUMO能级分别为-3.54和-4.97 eV。能级差（ΔE < 1.5 eV）表明该分子易于发生电子跃迁。这一特性通过聚集态下的空间限制增强了分子运动，直接提高了荧光效率，同时优化了光热转换，实现了激发态能量的协同调控。荧光光谱数据进一步证实了AXCB6优异的光热转换能力，表明当AXCB6被EVs-HMSN递送系统空间限制时，有望表现出更显著的光热转换性能。

为了进一步评估A/I@REHM的光热转换能力，我们使用实时红外热像仪评估了一系列浓度A/I@REHM的光热效应。在808 nm激光（1 W/cm2）连续照射下，A/I@REHM的温度随时间迅速升高，且呈浓度依赖性。在500 μg/mL时，溶液温度可达69.1°C；超过此点，浓度进一步增加导致温度变化稳定。这表明负载NLG919和REHM膜封装对AXCB6的光热性能影响很小。通过连续4次808 nm激光开/关循环评估了A/I@REHM的光热稳定性。每个循环包括5分钟激光照射和5分钟自然冷却。经过四次照射循环后，A/I@REHM表现出强大且持续的光热转换能力，温度仍升至约69.1°C，表明其光热响应的稳定性和可重复性。此外，从一个加热-冷却循环计算得出AXCB6的光热转换效率约为31.7%。这些发现证实A/I@REHM可以快速将NIR光能转化为热量，这是由于强给电子分子转子促进了分子内迁移。总之，增强的分子内运动结合精心设计的高度扭曲构象，赋予了A/I@REHM显著的光热转换和荧光成像能力（量子产率=2.6%）。

接下来，通过钙黄绿素/PI染色可视化细胞毒性，处理组包括磷酸盐缓冲盐水（PBS）、PBS + hv、REHM、I@REHM、A/I@REHM和A/I@REHM + hv。结果证实对照组对细胞活力抑制最小；经过808 nm激光处理后，细胞杀伤能力显著增强。这表明AXCB6介导的PTT可以直接诱导PAN02细胞死亡。此外，在不同浓度下有和无激光照射下，对PAN02和3T3细胞活力进行了比较分析。结果显示激光照射显著降低了细胞存活率，半数抑制浓度（IC₅₀）为75 μg/mL。流式细胞术的进一步定量显示最高细胞凋亡率超过46.5%。在Transwell实验中，A/I@REHM + hv也显示出最强的抑制细胞侵袭能力。

2.4 体外溶酶体逃逸和激光促进的药物释放

除了被肿瘤细胞或MCTs高摄取和强渗透性的特点外，新出现的证据表明EVs具有固有的逃避溶酶体降解的能力，从而避免内容物被破坏。如图4A所示，我们使用CLSM观察了不同时间点PAN02细胞摄取FITC@REHM的变化。孵育3小时后，FITC与溶酶体追踪器的荧光重叠最小（Pearson's Rr = 0.35），表明FITC@REHM尚未被溶酶体捕获；延长共孵育至6小时导致共定位显著增加（Rr = 0.84），表明被溶酶体捕获；而在9小时后，Rr值降至0.40，黄色荧光减少，证实FITC@REHM从溶酶体逃逸到细胞质中。以上结果表明REHM可以促进溶酶体逃逸并伴随低细胞毒性。此外，伪装成囊泡的A/I@REHM药物递送系统由含有NLG919和AXCB6的磷脂双分子层组成。808 nm激光照射不仅产生热量，还增强膜流动性以加速药物释放。在没有光照射的情况下，A/I@REHM的药物释放速率仅为7.7%；而在激光照射后，释放速率达到68.2%。同时，膜修饰增强了A/I@HM在PBS或胎牛血清（FBS）溶液中的稳定性。如图4D所示，伪装成囊泡的A/I@REHM在细胞中的摄取过程可总结如下：首先，A/I@REHM通过RGD表面修饰靶向并结合肿瘤细胞上过表达的α_vβ₃整合素，并通过质膜内吞作用被细胞摄取。然后，A/I@REHM通过内体-溶酶体途径被溶酶体捕获，受益于EVs的相似特性，从溶酶体中逃逸，然后将内容物释放到细胞质基质中，从而避免NLG919和AXCB6被降解。在808 nm激光照射下，AXCB6引起温度升高，这不仅增强膜流动性加速药物释放，还诱导激光触发的细胞死亡；同时，NLG919发挥抑制IDO1酶活性的作用。最终实现了光激活智能药物释放的目标。

2.5 体外抗肿瘤免疫评价

为了评估A/I@REHM的体外抗肿瘤免疫功效，从C57BL/6小鼠中分离和分化了M2巨噬细胞和T细胞（图5A）。随后，将A/I@REHM与M2巨噬细胞共孵育，并通过流式细胞术和RT-PCR评估极化状态。同时，用抗CD3CD28磁珠激活T细胞，然后与PAN02细胞上清液共培养。通过荧光监测上清液Trp水平，同时使用流式细胞术分析Edu⁺ T细胞增殖。通过整合这些结果，我们能够评估A/I@REHM的抗肿瘤免疫能力。

首先，鉴于M1-EVs使M2巨噬细胞复极化，来自M1-EVs的参与M1巨噬细胞极化的IL-6和TNF-α在A/I@REHM中得以保留。在本研究中，我们将REHM、I@REHM和A/I@REHM与从小鼠骨髓分离和分化的M2巨噬细胞一起孵育。我们分析了CD86（M1标志物，图5B）、CD206（M2标志物，图5C,D）表达的变化，以及M2巨噬细胞相关基因（Arg1和IL-10）和M1促炎细胞因子TNF-α的mRNA水平，通过RT-PCR进行评估。与PBS组相比，CD86⁺巨噬细胞结果显著增加，同时CD206⁺巨噬细胞显著减少。此外，RT-PCR结果显示Arg1和IL-10的mRNA水平降低，而TNF-α水平增加。同时，免疫细胞化学分析显示M2巨噬细胞蛋白CD206显著增加。总之，很明显，工程化的REHM、I@REHM和A/I@REHM尽管源自M1-EVs，但仍保留了负责调节复极化的有效成分。

其次，NLG919通过减少犬尿氨酸合成同时抑制Tregs和促进效应T细胞增殖表现出双重免疫调节作用。为了系统评估A/I@REHM制剂的持续抑制功效，我们建立了一个包含PAN02细胞和CD3CD28激活的T细胞的小鼠来源共培养系统。这个实验平台使我们能够比较评估四种基于NLG919的制剂：游离NLG919、I@REHM、A/I@REHM和A/I@REHM + hv。经过48小时孵育后，综合分析揭示了三个关键发现：第一，流式细胞术显示，与PBS对照组相比，所有治疗组均表现出显著的T细胞增殖，其中封装制剂（I@REHM、A/I@REHM和A/I@REHM + hv）的效果优于游离NLG919。第二，通过Trp/Kyn代谢分析，我们证实这些制剂保持了抑制Kyn的能力，Trp消耗率与T细胞扩增呈负相关。值得注意的是，虽然光热条件诱导了IDO1蛋白上调，但激光触发的NLG919从A/I@REHM中释放通过有效的IDO1酶抑制抵消了这种效应。总之，如图5J总结，我们的结果表明A/I@REHM递送系统保留了基于NLG919的IDO1抑制的核心药效学特性，抑制Kyn积累，从而缓解免疫抑制性TME，促进抗肿瘤T细胞反应。

2.6 体内协同治疗效果评价

鉴于AXCB6在NIR-II窗口的强吸收和荧光发射以及优异的光热转换性能，我们对负载AXCB6的A/I@REHM在PAN02荷瘤小鼠上进行了体内NIR-II荧光成像和光热成像，以评估在肿瘤病灶部位的分布和合适的曝光时间（图6A）。首先，通过尾静脉向PAN02荷瘤小鼠注射A/I@REHM以评估NIR-II成像性能。如图6B,C所示，A/I@REHM在肿瘤区域的NIR-II荧光信号逐渐增强，并在注射后8小时达到最大值，是初始值的1.9倍。随后，随着体内持续的代谢周转，NIR-II信号开始下降。因此，基于A/I@REHM在肿瘤中的时间积累曲线，我们发现注射后8小时是肿瘤诊断和治疗的最佳时间。同时，我们使用热成像评估了体内光热性能。注射后8小时，用1 W/cm2激光照射肿瘤区域，并通过光热成像寻找合适的照射时间。如图6D,E所示，与PBS组相比，肿瘤区域的温度随着激光照射逐渐升高，在照射60秒时温度达到最大值（39.55°C）。这表明在1 W/cm2的光强下可以实现满意的光热效率。

为了进一步评估治疗效果，将携带PAN02肿瘤的C57BL/6小鼠随机分为6个治疗组：G1, PBS; G2, PBS + hv; G3, REHM; G4, I@REHM; G5, A/I@REHM; G6, A/I@REHM + hv。在感染后8小时，用808 nm激光（1 W/cm2）照射小鼠肿瘤区域180秒。在治疗期间监测肿瘤大小，并定性评估联合治疗的效果。

治疗21天后，各组小鼠体重无显著差异，表明不良反应轻微。同时，我们记录了治疗后肿瘤体积的变化和相应的肿瘤图像。未接受激光照射的组（G3、G4和G5）显示肿瘤体积稳定增长，表明单一免疫检查点治疗、单一复极化药物或组合表现出有限的抗肿瘤效果，无法有效抑制肿瘤生长。相比之下，G6显示出更有效的肿瘤抑制，证实了PTT和复极化在增强免疫检查点治疗中的协同作用。此外，我们关注了给药后生存曲线的变化。G6的生存期达到13周，远远超过其他实验组。这进一步表明该实验组降低了肿瘤复发和药物相关毒性的风险，显示出优异且安全的抗肿瘤效果。抗肿瘤效果表明，具有三叉戟功能的A/I@REHM可以在“消除局部免疫抑制屏障、抑制转移前微环境和增强系统性抗肿瘤 immunity”的三管齐下策略下，有效且高效地协同对抗肿瘤，同时消除肿瘤逃逸的风险，降低转移和复发的可能性。

最后，通过组织学分析了解抗肿瘤特性。苏木精-伊红（H&E）染色显示，G6组的肿瘤细胞密度低于其他组，并且有更多的凋亡细胞。同时，Ki67和Tunnel的结果显示，Ki67阳性细胞较少，而Tunnel阳性细胞较多，存在大规模的DNA降解和碎片，这归因于PTT和复极化的联合协同效应，增强了ICB的治疗效果。同时，EVs具有良好的渗透性和靶向能力，增强了在肿瘤区域的积聚，抑制细胞增殖并诱导凋亡，从而实现了良好的抗肿瘤效果。

2.7 体内免疫激活

为了阐述A/I@REHM在808 nm激光照射下触发的抗肿瘤免疫反应机制，我们进一步测量了肿瘤中的免疫细胞反应（图7A）。首先，在808 nm激光照射下，我们评估了A/I@REHM诱导的肿瘤PTT效应。如图7B,C和图S21所示，在不同处理后检测了DAMP相关分子CRT和HMGB1的荧光信号。值得注意的是，与其他组