三重态能量转移敏化的NIR-II发光纳米探针用于超灵敏检测前列腺特异性抗原

本文报道了一种基于三重态能量转移（TET）敏化的近红外二区（NIR-II）下转移发光免疫吸附分析法（TET-DLISA），通过将羧基化近红外染料Cypate与尺寸优化的NaGdF4:Yb3+/Er3+下转移纳米颗粒（DSNPs）功能化作为信号报告分子，实现了对前列腺特异性抗原（PSA）的无背景干扰、超灵敏检测（检测限达98 fg mL?1），为前列腺癌术后复发监测提供了突破性解决方案。

　　

1 引言

前列腺癌（PCa）是全球男性第二高发的恶性肿瘤，构成重大健康挑战。作为前列腺癌临床不可或缺的肿瘤标志物，前列腺特异性抗原（PSA）在早期筛查、诊断和管理中起着关键作用。早期疾病中，血清PSA水平通常低于4 ng mL^?1，而根治性前列腺切除术后的患者需要监测超低浓度（<1 pg mL^?1）的残留PSA，以便及时识别前列腺癌的生化复发。早期识别痕量水平的残留PSA对于提高根治性前列腺切除术患者的术后生存率至关重要。

然而，传统的PSA免疫分析法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、化学发光（CL）免疫分析和侧向流动免疫分析，在复杂的生物样品中常常受到灵敏度不足和高背景干扰的限制，这为早期诊断和精确治疗监测带来了主要障碍。因此，开发具有高信背比（SBR）、能够定量飞克级PSA的高灵敏度、无背景检测平台仍然是一个关键挑战。

近年来，镧系元素掺杂纳米颗粒（LnNPs）因其卓越的光稳定性、窄带发射谱、毫秒级光致发光（PL）寿命以及从紫外到第二近红外（NIR-II, 1000–1700 nm）窗口的宽光谱响应，已成为下一代生物传感纳米探针的有力候选者。这些优势使得利用LnNPs通过三种不同模式（上转换发光（UCL）、具有长PL寿命的下转移发光（DSL）和NIR-II发光）实现高信背比的无背景发光生物测定成为可能。特别是，NIR-II发射通过最小化组织散射和自发荧光，同时显著提高信背比，克服了可见光（400–700 nm）和NIR-I（700–900 nm）检测系统固有的关键限制。

尽管有这些优点，LnNPs仍面临固有挑战，包括固有的低吸收截面（～10^?21 cm²）、高激发阈值和次优的PL性能。为了克服这些缺陷，具有大吸收截面的有机近红外染料被策略性地用作敏化剂，通过天线效应放大LnNPs的PL性能。值得注意的是，与传统的单线态能量转移敏化相比，TET不仅通过直接的表面配体工程促进高效的能量转移，而且避免了近红外激发源与镧系离子吸收之间的竞争性吸收和光谱重叠。这些协同优势共同增强了LnNPs的PL性能，从而显著提高了生物传感的灵敏度、特异性和信背比。

本研究开发了一种利用TET敏化的NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺下转移纳米颗粒（DSNPs）的NIR-II PL发射来超灵敏检测飞克级PSA的独特策略。通过利用羧基功能化的近红外（NIR）染料Cypate作为锚定在DSNP表面的天线分子，在808 nm激发下，通过有效敏化Cypate的三重态（T₁），实现了Er³⁺离子在1524 nm处NIR-II DSL发射的显著增强。这种设计明显促进了Cypate内部的自旋-轨道耦合和系间窜越（ISC）动力学，这是由DSNPs中Gd³⁺离子的未配对4f电子和顺磁效应驱动的，从而导致NIR-II DSL发射强度急剧增加。有趣的是，TET敏化的DSNPs表现出粒径依赖性的NIR-II DSL性能增强，这与NIR染料在DSNP表面的界面结合构型直接相关，最终为PSA实现了卓越的信背比值和前所未有的检测灵敏度。此外，808 nm近红外激发和NIR-II发射都最大限度地减少了生物自发荧光和散射，实现了无背景信号读出，并验证了其在监测根治性前列腺切除术后患者前列腺癌生化复发方面的临床实用性。通过整合这些优势，我们的方法可以解决传统免疫分析的关键局限性，为早期精确诊断、疾病监测和临床预后评估提供一个有前景的平台。

2 结果与讨论

通过使用NaHF₂粉末作为氟源，采用改进的固-液-热分解方法获得了高质量的NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs。通过将反应温度从280°C调节到315°C来精确控制成核速率，我们实现了单分散、球形DSNPs的高度可重复合成，其直径可在5.8 ± 0.5 到 20.1 ± 0.8 nm之间调节。粉末X射线衍射（PXRD）分析证实，所合成的NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs均结晶为六方晶系的NaGdF₄。选区电子衍射（SAED）图样显示出强烈的衍射环，可很好地指标化为六方NaGdF₄。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像显示出清晰的晶格条纹，观察到的d间距为0.52 nm，对应于六方NaGdF₄的（100）晶面。能量色散X射线（EDX）光谱、扫描透射电子显微镜（STEM）元素分布图和X射线光电子能谱（XPS）验证了Na、F、Yb、Er和Gd在DSNPs内的均匀分布。

在980 nm激发下，NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs在1524 nm（⁴I_13/2→⁴I_15/2）处显示出宽的NIR-II DSL发射峰，其强度与DSNP尺寸的增加呈正相关。相应地，Er³⁺的⁴I_13/2→⁴I_15/2跃迁的有效PL寿命从0.68 ms（5.8 nm DSNPs）增加到1.45 ms（20.1 nm DSNPs）。这种粒径依赖的NIR-II DSL性能增强归因于较大DSNPs中表面缺陷的减少。

为了有效增强所获DSNPs的DSL性能，我们进一步采用了TET敏化策略，使用羧基化近红外染料Cypate，它可以与DSNPs表面结合，并显示出与NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs中Yb³⁺的基态吸收具有优异的三重态磷光光谱重叠，使其成为理想的近红外吸收天线。特别是，XPS分析证实了Cypate与表面Ln³⁺离子的配位，这由O 1s结合能的明显位移所证明，从而确保了高效的界面能量转移。这种方法通过将Cypate锚定在DSNP表面，显著提高了近红外吸收效率，从而能够显著放大NIR-II发射。在808 nm激发下，Cypate有效捕获入射光子，促进电子从基态（S₀）激发到单重激发态（S₁），随后高效地发生系间窜越到三重激发态。DSNPs内Gd³⁺离子的未配对4f电子自旋和顺磁效应促进了Cypate打破从S₁到T₁的禁戒跃迁，进一步提高了系统的ISC效率。值得注意的是，Yb³⁺的²F_5/2态与Cypate的T₁态之间的能隙小，导致Cypate的磷光发射与Yb³⁺的吸收带之间有86%的光谱重叠，从而促进了从Cypate的T₁态到Yb³⁺的²F_5/2态的有效TET，并最终增强了源于Er³⁺的⁴I_13/2→⁴I_15/2跃迁的NIR-II DSL发射。此外，在低温（80 K）下进行的时间分辨光致发光（TRPL）测量显示，在NaGdF₄ NPs中引入稀土离子显著猝灭了Cypate在975 nm的特征T₁发射，为Cypate和Yb³⁺之间的有效TET提供了有力证据。为了排除单线态能量转移的贡献，进行了使用环辛四烯（COT）的猝灭实验。结果显示，向NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺@Cypate体系中加入COT导致DSL信号减少约93%，表明从Cypate到镧系离子的能量转移主要通过TET途径而非SET途径发生。对不同染料负载量的DSNPs的NIR-II DSL发射研究表明，DSNPs@Cypate的最佳染料量为2.5 μg mL^?1。特别是，DSL增强表现出尺寸依赖性，在相同实验条件下，5.8 nm DSNPs的DSL强度增加了284倍，而20.1 nm DSNPs仅观察到32倍的增加。同时，Cypate敏化显著提高了所有尺寸DSNPs的NIR-II光致发光量子产率（PLQY），其中5.8 nm DSNPs实现了高达10.9%的PLQY。这种DSNP@Cypate体系NIR-II发射的尺寸依赖性增强可能归因于较小DSNPs中增加的表面体积比，这使得Cypate分子更接近DSNPs，从而促进了更有效的能量转移和高度改善的DSL发射。

为了进一步评估DSNP粒径对TET效率的影响，利用飞秒瞬态吸收（fs-TA）光谱来探测染料敏化过程中Cypate的激发态动力学。在808 nm飞秒脉冲激光激发下，游离的Cypate在560 nm处表现出一个正的瞬态吸收（TA）信号，归属于激发态吸收（ESA），以及两个负的TA信号，对应于基态漂白（GSB）和受激发射（SE）。在830 nm处监测的SE恢复动力学轨迹为S₁激子弛豫动力学提供了关键见解。值得注意的是，Cypate与NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs的结合显著加速了SE信号的恢复，相对于没有Yb³⁺/Er³⁺掺杂的光学惰性NaGdF₄ NPs。此外，Cypate的有效激发态寿命在NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺@Cypate体系内发生了显著缩短。具体来说，当锚定在20.1 nm DSNPs上时，Cypate的寿命从559.9 ps减少到275.7 ps，而当锚定在5.8 nm DSNPs上时，进一步下降到96.3 ps。这种加速的衰减表明从S₁到T₁的激子弛豫增强，最终将ISC效率从20.1 nm DSNPs的50.8%提高到5.8 nm DSNPs的82.8%。较小DSNPs中较高的TET效率源于其更大的染料结合表面积以及Cypate与受体离子之间缩短的距离，这些因素协同增强了界面能量转移。这些发现揭示了减小的粒径可以赋予DSNP@Cypate系统增强的ISC效率、更有效的TET和放大的NIR-II DSL发射。

为了研究Cypate界面状态对DSL信号响应灵敏度的影响，选择磷酸根（PO₄^3?）离子作为模型竞争配体，逐步引入以置换DSNP@Cypate体系中的Cypate。由于磷酸根离子中P=O基团的配位能力强于Cypate中C=O基团，随着磷酸根离子占据其结合位点，先前结合的Cypate分子逐渐从DSNP表面脱离。随着磷酸根离子浓度的增加，更多的Cypate分子被替换，导致DSL强度逐渐降低。在0–300 ng mL^?1的磷酸根浓度范围内，NIR-II DSL强度变化（ΔDSL）与磷酸根浓度之间建立了线性关系，从而能够定量评估碱性磷酸酶（ALP）活性。值得注意的是，在磷酸根离子浓度为500 ng mL^?1时，5.8 nm NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺@Cypate体系中的1524 nm NIR-II DSL被完全猝灭（为初始DSL强度的0.27%）。这种完全猝灭意味着几乎所有的Cypate分子都已被置换，从而停止了TET介导的敏化过程。这些发现表明，即使Cypate结合构象的微小变化也能显著影响TET效率和NIR-II DSL发射，揭示了NIR-II DSL响应对界面配体动力学的高度敏感性。

此外，通过fs-TA光谱监测了磷酸根离子对Cypate的动态置换过程。在808 nm飞秒激光激发下，结合在5.8 nm NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs上的Cypate在830 nm处的特征SE信号的有效寿命从519.8 ps减少到96.3 ps。引入磷酸根离子后，Cypate的SE信号衰减表现出显著延迟，导致寿命延长至480.3 ps，与游离Cypate的寿命相当。此外，竞争性置换机制通过荧光各向异性测量得到验证，结果显示加入磷酸根后，各向异性（r）值从0.17（结合状态）下降到0.03（游离状态），证实了Cypate从DSNP表面释放。通过比较Cypate在游离状态、与DSNPs结合状态以及被磷酸根离子竞争释放状态下的动力学曲线，我们推断Cypate在与DSNPs相互作用时经历了从游离状态到结合状态的动态转变，随后通过磷酸根离子的竞争置换返回到游离状态。这些发现表明磷酸根离子与Cypate在DSNP表面结合位点上存在有效竞争。此外，随着粒径减小，磷酸根离子响应的信背比值急剧增加至~273，显著增强了检测性能。这些发现揭示了表面结合近红外染料的配位动力学在调节高灵敏度NIR-II DSL响应中的关键作用，从而为开发高灵敏度TET基NIR-II生物传感平台提供了一条有前景的途径。

受通过磷酸盐介导的竞争置换调节TET敏化DSNPs上Cypate界面状态从而实现超灵敏NIR-II DSL响应的启发，我们进一步将该系统应用于开发用于检测PSA的夹心免疫分析法。对于临床检测，血清PSA水平超过4 ng mL^?1表明可能存在前列腺癌，而根治性前列腺切除术后的水平通常降至约1 pg mL^?1。因此，在1 pg mL^?1 到 4 ng mL^?1范围内进行超灵敏PSA检测对于监测前列腺癌复发或转移、实现及时干预以及指导辅助或挽救性治疗至关重要。在我们的检测中，目标PSA首先被特定的捕获抗体捕获在微孔板孔表面，然后与生物素化的检测抗体结合形成夹心免疫复合物。随后，通过特异性生物素-亲和素相互作用，将亲和素偶联的碱性磷酸酶（Avidin-ALP）锚定在免疫复合物上。加入酶底物对硝基苯磷酸酯（pNPP）和作为NIR-II DSL报告分子的DSNP@Cypate后，ALP催化pNPP水解产生磷酸根离子，这些离子竞争性地将Cypate从DSNP表面置换下来，引发显著的NIR-II DSL信号响应。由于抗体-抗原结合的特异性，产生的ΔDSL强度与ALP生物催化活性直接相关，而ALP活性与PSA浓度定量成正比。

在808 nm激发下，随着PSA校准曲线中PSA浓度的增加，NIR-II ΔDSL信号逐渐增强，并且在0.5 到 128 pg mL^?1的极低检测范围内，ΔDSL信号强度呈现线性响应。值得注意的是，TET-DLISA平台实现了出色的信背比273和超低的检测限（LOD）98 fg mL^?1，该LOD计算为对照组（在相同条件下用BSA替代）测得信号的三倍标准偏差所对应的PSA浓度。这样的LOD比传统的基于ALP的ELISA（LOD = 104 pg mL^?1）提高了约1000倍，并且优于迄今为止报道的最好的发光免疫吸附分析法（LOD = 0.52 pg mL^?1）的检测性能。与其他通常需要复杂底物制备且易受环境干扰的灵敏技术相比，TET-DLISA平台具有更高的简便性、最小的背景干扰以及在复杂介质中的稳健性能，使其特别适合临床转化。此外，所提出平台的稳健性通过测定内重复性测试得到进一步证明，结果显示变异系数（CVs）低于5.0%，证实了其优异的操作重现性。此外，在检测低浓度（32 pg mL^?1）的PSA时，在缓冲液和人血清之间观察到最小的信号变异，揭示了该方法在复杂生物基质内区分痕量PSA信号的卓越抗干扰能力。此外，TET敏化DSNPs的ΔDSL信号表现出优异的稳定性，在人血清中分散6小时后显示出可忽略的降解，从而证实了PSA检测过程中平台的稳健性。

为了进一步评估TET-DLISA检测法的特异性，进行了用非特异性蛋白质和潜在干扰分析物替代PSA的实验。所有干扰物产生的ΔDSL信号均可忽略不计，并且在统计上与空白对照无法区分。形成鲜明对比的是，PSA样品即使浓度比竞争分析物低10倍，也表现出显著的ΔDSL响应。这种卓越的特异性直接源于检测设计中高亲和力的抗体-抗原结合，证实了该平台对目标PSA检测的选择性。此外，为了评估其临床实用性，研究了TET敏化DSNPs用于PSA定量的分析精密度和准确度。在加标人血清中的精密度测试产生的CV值低于7.0%，回收率在95%到110%之间，这完全符合标准生物分析验证标准（CV ≤ 15%；回收率：90%–110%），进一步验证了该方法作为超灵敏诊断平台在临床部署中的可靠性和适用性。

受到TET-DLISA平台卓越灵敏度和特异性的鼓舞，我们进一步评估了其定量检测从福建医科大学孟超肝胆医院接受根治性前列腺切除术的复发（n = 15）和非复发（n = 15）前列腺癌患者临床血清样本中PSA的能力。这些样本已预先使用医院临床实验室通过罗氏CL仪器进行的商业Mérieux CL试剂盒进行诊断。值得注意的是，来自非复发患者的血清样本表现出可忽略的NIR-II DSL信号变化，而所有复发样本均产生显著的ΔDSL响应。重要的是，通过TET-DLISA定量的PSA水平与通过Mérieux CL试剂盒获得的结果显示出极好的一致性，这两种方法之间存在强烈的线性相关性证明了这一点，从而验证了所提出平台的分析准确性和诊断可靠性。这些发现证明了TET-DLISA作为前列腺切除术后患者早期PSA检测的高度特异性和超灵敏平台具有临床可转化性，能够实现及时的临床干预和优化的治疗管理。

3 结论

总之，我们开发了一种独特的TET-DLISA平台，用于超灵敏、无背景干扰地检测肿瘤标志物PSA，满足了前列腺切除术后患者前列腺癌复发早期诊断的关键未满足需求。通过策略性地将羧基功能化的染料天线Cypate与尺寸优化的NaGdF₄:Yb³⁺/Er³⁺ DSNPs集成，我们在808 nm激发下通过高效的TET敏化，实现了1524 nm处NIR-II发射的284倍放大。特别是，粒径依赖的界面能量转移动力学揭示，亚6 nm DSNPs显著提高了ISC效率（82.8%）和NIR-II发射性能，克服了镧系纳米颗粒的固有局限性。通过利用磷酸盐介导的天线染料竞争性置换，我们实现了273的信背比和低至98 fg mL^?1的PSA检测限，比相应的基于ALP的ELISA提高了三个数量级。更重要的是，临床验证证实了与商业试剂盒的强相关性，揭示了其在识别根治性前列腺切除术后患者PSA复发方面的可靠性。这些发现确立了一种TET驱动的NIR-II放大策略，不仅能够实现超灵敏的NIR-II PL信号响应，而且消除了痕量水平肿瘤标志物检测中的背景干扰，从而为精准肿瘤学和床旁诊断提供了变革性潜力。