Fto通过Kcne1 m6A去甲基化促进衰老小鼠心房颤动易感性的机制研究

本研究揭示了衰老进程中心房颤动（AF）的新型表观转录组调控机制。研究发现，衰老小鼠心房组织中m6A去甲基酶Fto表达升高，导致钾通道亚基Kcne1的mRNA发生m6A去甲基化，进而通过影响其前体mRNA剪接、核输出及翻译效率，降低Kcne1蛋白水平，增强慢延迟整流钾电流（IKs），缩短动作电位时程（APD），最终增加AF易感性。该机制在AF患者样本及iPSC来源的心肌细胞中得到验证，表明靶向Fto-m6A-Kcne1通路可能是治疗衰老相关AF的潜在策略。

　　

1 引言

心房颤动（AF）是一种常见的心律失常，其特征是心跳不规则且快速。其患病率随着年龄增长而增加，年龄是AF不良结局的独立危险因素。尽管导管消融术有效，但老年患者面临更高的复发率。衰老相关AF的潜在机制仍知之甚少，这阻碍了治疗方法的开发。

RNA修饰在调控转录后基因表达中扮演重要角色，影响mRNA的稳定性、定位和翻译。在已知的140多种RNA化学修饰中，N6-甲基腺苷（m⁶A）是最丰富且动态调控的修饰之一。它已被证明对心脏发育、功能和应激反应至关重要。值得注意的是，最近的研究表明m⁶A修饰参与衰老过程和年龄相关疾病。m⁶A的沉积和去除分别由甲基转移酶（如METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基酶（包括FTO和ALKBH5）催化。FTO已被证明影响代谢特征和心脏病理生理学，越来越多的证据表明其参与衰老的调控。

心脏动作电位受到离子通道复合物的严格调控。KCNQ1与其调节亚基KCNE1组装后，介导慢激活延迟整流钾电流（I_Ks），这对心肌复极化至关重要。KCNE1在心脏中高表达，并调节KCNQ1通道的门控和动力学。KCNE1功能丧失会缩短动作电位时程，增加对心房心律失常（包括AF）的易感性。最近的进展表明，包括m⁶A在内的RNA修饰可以转录后微调关键离子通道亚基的表达，提供了表观转录组调控与衰老心房电重构之间的潜在联系。

2 结果

2.1 衰老与小鼠AF诱导性增加相关

研究人员通过程序性电刺激评估了15至24月龄雄性小鼠的AF诱导性。结果显示，从19月龄开始可观察到诱发的AF发作，到24月龄时更为显著，表现为频率和总持续时间增加。通过光学标测发现，与2月龄小鼠相比，19月龄小鼠心房电位激活时间增加了1.3倍，24月龄小鼠增加了2倍。与成年小鼠相比，衰老小鼠（19月龄和24月龄）的传导异质性增强，APD₉₀持续时间缩短。此外，衰老小鼠的APD_30/80比值更高，APD₃₀持续时间不变，APD₈₀持续时间缩短，表明APD的缩短主要源于复极化期。全细胞膜片钳记录表明，衰老小鼠的APD₉₀短于成年小鼠。此外，与2月龄成年小鼠相比，19月龄小鼠的左房直径（LAD）显著增加（1.3倍），但24月龄小鼠的差异更为明显（1.69倍）。Masson染色显示，与2月龄小鼠相比，19月龄小鼠左房纤维化轻度增加，而在24月龄小鼠中观察到更严重的左房纤维化（2.67倍）。基于这些发现，研究聚焦于阐明19月龄小鼠AF的机制。

2.2 衰老与心房m⁶A下调相关

研究人员对心房组织样本进行了RNA修饰的全局分析。结果显示，在六种主要mRNA修饰中，m⁶A甲基化在19月龄小鼠中显著下调。为了进一步研究特定基因中m⁶A修饰的变化，他们对2月龄和19月龄小鼠的心房组织进行了m⁶A测序（m⁶A-seq）。主成分分析（PCA）显示各组三个生物学重复之间数据重现性良好。m⁶A-seq分析鉴定出2月龄和19月龄小鼠心房组织中平均分别有9664和8676个m⁶A峰。与2月龄小鼠组织相比，衰老心房中有2362个m⁶A峰下调，113个峰上调。m⁶A甲基化位点的分布模式显示，GGAC motif在衰老组和成年组的m⁶A位点中均高度富集，而成年组的m⁶A甲基化峰值高于衰老组。此外，小鼠心房中的m⁶A峰在外显子和3‘UTR区域丰富。通过mRNA-seq发现，在评估的16,946个基因中，两组之间有889个基因存在差异表达。与2月龄小鼠相比，衰老组有309个基因显著上调，580个基因下调。为了确定与衰老小鼠m⁶A依赖性AF相关的潜在下游靶点，研究人员识别出949个m⁶A下调基因和580个mRNA下调基因之间的重叠基因，共42个。

2.3 衰老心房中受损的Kcne1 m⁶A修饰与电重构相关

在42个与心房衰老相关的推定候选基因（在m⁶A-seq和mRNA-seq中均下调）中，Kcne1是唯一已知影响离子通道功能的目标基因。m⁶A-seq数据进一步证实，与成年组相比，衰老组Kcne1 mRNA在其CDS和3’UTR区域内的m⁶A富集度较低。通过m⁶A甲基化RNA免疫共沉淀qPCR（MeRIP-qPCR）验证，19月龄小鼠心房Kcne1的甲基化水平比2月龄小鼠低10倍。同时，发现19月龄小鼠心房中Kcne1的mRNA水平比2月龄小鼠低4倍。Western blotting显示，19月龄小鼠心房中Kcne1的蛋白水平显著降低，而Kcnq1和Kcne2的蛋白水平无显著变化。衰老小鼠心房心肌细胞中的I_Ks电流密度比成年小鼠更强。

为了进一步表征Kcne1在小鼠中的功能，研究人员通过注射携带靶向shKcne1的腺相关病毒血清型9（AAV9）来研究2月龄小鼠中Kcne1敲低的影响。免疫印迹验证了Kcne1在心房和心室中的敲低效率。结果显示，与对照小鼠相比，AAV9-cTnT-shKcne1小鼠的AF诱导性实验显示AF倾向显著增加，AF持续时间更长。此外，AAV9-cTnT-shKcne1小鼠的激活时间更长，传导离散度增强，APD₉₀持续时间缩短，APD₃₀持续时间不变，APD₈₀持续时间缩短，APD_30/80延长。AAV9-cTnT-shKcne1小鼠的总钾电流和I_Ks电流均增强。AAV9-cTnT-shKcne1小鼠与AAV9-cTnT-nc小鼠之间的LAD无差异。此外，AAV9-cTnT-shKcne1小鼠与对照小鼠之间的心房纤维化面积无显著差异。心室功能的超声心动图参数显示，与对照小鼠相比，AAV9-cTnT-shKcne1小鼠未见显著差异。

2.4 心肌细胞特异性过表达Kcne1改善衰老小鼠的电重构

为了确定Kcne1在老年雄性小鼠AF诱导性中的作用，研究人员向2月龄和18月龄小鼠静脉注射携带cTnT启动子以驱动Kcne1过表达的AAV9（AAV9-cTnT-Kcne1-oe）。AAV9静脉注射一个月后，进行超声心动图测量，随后进行电刺激，然后取组织进行后续实验。结果显示，过表达Kcne1降低了衰老诱导的AF诱导性。此外，衰老诱导的特征，如延长的激活时间、增强的离散度、缩短的APD₉₀、缩短的APD₈₀以及增加的APD_30/80，均通过过表达Kcne1得到改善。同时，过表达Kcne1降低了衰老诱导的心房心肌细胞总钾电流和I_Ks电流的增强。在过表达Kcne1的成年小鼠中未观察到此类现象。此外，衰老诱导的心房扩大和纤维化不受Kcne1过表达的影响。基于这些发现，研究人员认为19月龄小鼠的AF诱导性可归因于心房电重构。

2.5 衰老小鼠和AF患者心房中FTO增加，并与m⁶A水平和KCNE1蛋白水平负相关

通过Western blotting评估了2月龄和19月龄雄性小鼠心房组织中m⁶A去甲基酶Fto和Alkbh5，以及甲基转移酶Mettl3、Mettl14和Wtap的蛋白水平。结果显示，衰老小鼠心房中Fto的蛋白水平显著增加（3倍），而Mettl3、Mettl14、Wtap和Alkbh5在两组间无差异。有趣的是，发现两组间的Fto mRNA水平无显著差异，这提示衰老小鼠中Fto蛋白降解可能被阻断。研究人员进一步分离了心房中的心肌细胞和成纤维细胞，并通过Western blotting分析发现，老年小鼠的心房心肌细胞和成纤维细胞中Fto蛋白水平均升高；然而，心肌细胞中Fto水平的差异在2月龄和19月龄心房之间更为显著。值得注意的是，Kcne1蛋白主要在心房心肌细胞中表达，而非成纤维细胞。免疫组织化学染色实验的结果与Western blotting研究一致，均显示19月龄小鼠心房心肌细胞核中Fto增加，同时m⁶A水平降低。

研究人员招募了24名接受搭桥手术且左心室功能保留（LVEF > 50%）的冠状动脉疾病患者，分为年龄、性别和合并症匹配的队列，12名伴有AF，12名无AF。收集患者的左心耳（LAA）样本；通过免疫染色发现，FTO随组织年龄显著增加。无论非AF患者还是AF患者，FTO增加均伴有低水平的m⁶A。与年龄相仿的非AF患者相比，AF患者的FTO水平增加更多。与此发现一致，通过Western blotting观察到，在有或没有AF的患者中，FTO免疫印迹信号与KCNE1水平呈负相关。

2.6 在雌性小鼠中验证衰老诱导的电重构和Kcne1 m⁶A去甲基化

在2月龄和19月龄雌性小鼠中测试了AF诱导性、心房电传导、总钾电流和I_Ks电流强度，以及LAD和纤维化。在19月龄雌性小鼠中观察到衰老诱导的AF诱导性增加、心房电传导紊乱、钾电流和I_Ks电流增强，以及心房扩大和纤维化。2月龄雄性和雌性小鼠之间未见性别相关差异。此外，衰老诱导的Fto增加和Kcne1减少也在老年雌性小鼠中得到验证，且同一年龄的雌性小鼠Fto变化比雄性小鼠更显著。成年雄性和雌性小鼠心房中的总m⁶A水平相当，但老年雌性小鼠的m⁶A减少似乎更为明显。通过MeRIP-qPCR发现，无论是成年小鼠还是老年小鼠，Kcne1 m⁶A水平在雄性和雌性小鼠之间相似。老年雌性和雄性小鼠之间的心室功能未见显著差异。

2.7 心肌细胞特异性敲除Fto减轻衰老诱导的AF

为了确定Fto在老年小鼠AF中的作用，研究人员将Myh6-cre小鼠与Fto^fl/fl小鼠杂交，生成心肌细胞特异性Fto敲除小鼠。将Myh6-cre⁺; Fto^fl/fl小鼠和Myh6-cre^-; Fto^fl/fl小鼠饲养至19月龄。AF诱导性实验显示，在19月龄时，Myh6-cre^-; Fto^fl/fl小鼠的AF倾向和AF持续时间显著大于Myh6-cre⁺; Fto^fl/fl小鼠，然而在2月龄时研究的两种小鼠之间没有这种差异。此外，验证了心肌细胞Fto敲除小鼠与对照小鼠相比，在19月龄时激活时间缩短，传导离散度降低，APD₉₀增加，APD_30/80比值降低，APD₃₀持续时间不变，APD₈₀持续时间增加。在细胞水平，从19月龄Myh6-cre⁺; Fto^fl/fl小鼠分离的心房心肌细胞记录的总钾电流和I_Ks电流小于从Myh6-cre^-; Fto^fl/fl小鼠记录的电流。此外，与19月龄的Myh6-cre^-; Fto^fl/fl小鼠相比，Myh6-cre⁺; Fto^fl/fl小鼠的心房衰老诱导的心房扩大和纤维化并未减少。

2.8 成年小鼠心肌细胞特异性过表达Fto以m⁶A依赖性方式增加AF易感性

为了确定Fto表达与其对Kcne1的去甲基酶功能之间的功能关系，研究人员向2月龄雄性小鼠静脉注射AAV9以驱动野生型Fto过表达（AAV9-cTnT-Fto^wt-oe），同时平行进行实验，向小鼠注射编码Fto变体（其去甲基酶功能位点突变I367F）的AAV9（AAV9-cTnT-Fto^mut-oe），该突变使其活性降低80%。AAV9静脉注射一个月后，进行超声心动图测量，随后进行电刺激，然后取组织进行后续实验。结果显示，过表达野生型Fto，而非其催化失活突变体，与心房组织中Kcne1蛋白减少相关，同时心房总m⁶A水平降低。此外，过表达野生型Fto（而非突变体）增加了AF诱导性，延长了激活时间，增强了离散度，缩短了APD₉₀持续时间，增加了APD_30/80，APD₃₀持续时间不变，APD₈₀持续时间缩短。来自AAV9-cTnT-Fto^wt-oe小鼠的心房心肌细胞的总钾电流和I_Ks电流增强，而在AAV9-cTnT-nc小鼠和AAV9-cTnT-Fto^mut-oe小鼠中未观察到。三组之间的LAD和纤维化面积未发生变化。超声心动图参数显示，突变体Fto或野生型Fto的过表达均未改变小鼠的心室功能。

2.9 心肌细胞特异性过表达Kcne1减轻小鼠由Fto过表达引起的AF易感性增加

为了验证Kcne1过表达是否能挽救由Fto过表达可能导致的AF易感性增加，研究人员向2月龄雄性小鼠静脉注射AAV9-cTnT-Fto-oe，同时注射或不注射AAV9-cTnT-Kcne1-oe。AAV9静脉注射一个月后，进行超声心动图测量，随后进行电刺激，然后取组织进行后续实验。Fto过表达显著降低了过表达的Kcne1的mRNA水平。在AAV9-cTnT-Fto-oe组中，观察到Kcne1的CDS区域内m⁶A修饰显著减少。过表达AAV9对照和Kcne1的小鼠无法诱导出AF。与仅过表达Fto的小鼠相比，同时过表达Fto和Kcne1的小鼠AF诱导性增加得到挽救。此外，在同时过表达Fto和Kcne1的小鼠中，发现激活时间缩短，离散度减弱，APD₉₀持续时间延长，APD_30/80缩短，APD₃₀持续时间不变，APD₈₀持续时间延长。Fto过表达诱导的心房心肌细胞总钾电流和I_Ks电流增强也通过Kcne1过表达得到挽救。

2.10 FTO通过降低KCNE1 m⁶A甲基化水平影响KCNE1 mRNA转录和翻译

在人多能干细胞来源的心房心肌细胞（iPSC-aCMs）中研究了FTO介导的KCNE1 m⁶A修饰的潜在机制。首先通过免疫荧光染色确认了iPSC-aCMs的成功生成。接下来，用携带空载体（Ad-vector）、FTO（Ad-FTO^wt）或催化失活突变型FTO（Ad-FTO^mut）的腺病毒制剂感染iPSC-aCMs培养物。从这些实验中发现，过表达野生型FTO（而非其催化失活突变体）导致KCNE1显著减少。Western blotting显示，三组细胞裂解液样品中KCNE1蛋白的半衰期无差异，表明蛋白稳定性不受FTO影响。Ad-FTO^wt细胞中KCNE1的成熟mRNA水平显著低于Ad-vector组和Ad-FTO^mut组。值得注意的是，Ad-FTO^wt细胞中KCNE1前体mRNA和成熟mRNA的半衰期显著长于Ad-vector组和Ad-FTO^mut组的样品，表明KCNE1的RNA剪接和mRNA降解过程可能通过FTO诱导的KCNE1 m⁶A去甲基化机制而延迟。此外，通过分离胞浆和核mRNA，发现仅在Ad-FTO^wt细胞中KCNE1 mRNA的核/浆比值增加，提示m⁶A修饰减少导致mRNA在核内滞留。

通过双荧光素酶报告实验研究了m⁶A甲基化在CDS和3‘UTR区域对翻译效率的潜在作用。首先通过将KCNE1的3’UTR区域核苷酸序列连接到载体内的多克隆位点（MCS），构建了pmirGLO-KCNE1荧光素酶报告腺病毒。用该载体进行双荧光素酶 assay 发现，KCNE1的3‘UTR区域甲基化对翻译效率仅有轻微影响。在第二个实验中，用Ad-FTO^wt或Ad-FTO^mut与Ad-KCNE1共同感染iPSC-aCMs。发现过表达野生型FTO（而非突变体）降低了KCNE1的稳态蛋白水平，表明FTO可能通过其对KCNE1 mRNA CDS的m⁶A甲基化功能来影响其翻译效率，从而影响KCNE1水平。

2.11 基因敲除Fto或药理学抑制Fto去甲基酶活性可减轻衰老诱导的AF

研究人员希望通过病毒介导的shRNA敲低Fto来影响AF。向2月龄和19月龄雄性小鼠静脉注射AAV9-cTnT-shFto，以敲低心肌细胞中的Fto。AAV9静脉注射一个月后，进行超声心动图测量，随后进行电刺激，然后取组织进行后续实验。心房和心室组织的心肌细胞显示出可比的Fto敲低效率，以可检测到的Fto蛋白水平为代表。此外，衰老心肌细胞中Fto的减少与Kcne1的变化相关。Fto敲低导致成年和老年小鼠心房总m⁶A水平增加。结果显示，与对照组相比，心肌细胞特异性Fto敲低小鼠的衰老诱导的AF易感性以及电重构显著降低。此外，心肌细胞中Fto的缺失也减弱了老年小鼠总钾电流和I_Ks电流的增加。与20月龄的AAV9-cTnT-nc小鼠相比，AAV9-cTnT-shFto小鼠心房中衰老诱导的心房扩大和纤维化并未减少。

受这些发现指导，研究人员接下来测试了化学干扰m⁶A甲基化是否能调节小鼠模型中衰老诱导的AF。为此，将2月龄和19月龄雄性小鼠暴露于FB23（一种有效的选择性Fto抑制剂）4周，然后进行分析。给予FB23（5 mg/kg/周，腹腔注射）一个月后，进行超声心动图测量，随后进行电刺激，然后取组织进行后续实验。FB23对Fto蛋白水平没有抑制作用。由于推定的去甲基酶活性抑制，FB23暴露导致老年小鼠心房m⁶A水平降低。进一步发现，暴露于FB23降低了老年小鼠的AF易感性，表现为AF频率减少和AF持续时间缩短。此外，衰老诱导的心房电重构，包括缩短的激活时间、降低的传导离散度、增加的APD₉₀、降低的APD_30/80比值、不变的APD₃₀持续时间和延长的APD₈₀持续时间，均受到FB23暴露的显著影响。此外，FB23治疗减轻了衰老诱导的心房心肌细胞总钾电流和I_Ks电流的增加。与20月龄的对照小鼠相比，接受FB23治疗的小鼠心房中LAD和纤维化面积也显著减少。值得注意的是，FB23治疗导致老年小鼠衰老引起的体重增加减少。

3 衰老心房中持续的PGE2通过抑制FTO泛素化阻遏其降解

衰老细胞合成氧脂素，这是一类由多不饱和脂肪酸（PUFAs）氧化产生的生物活性脂质，可以驱动细胞进入衰老表型。对心房组织进行的氧脂素分析显示，19月龄小鼠心房中有13种氧脂素增加，3种减少。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析表明，花生四烯酸代谢受影响最为显著。在13种升高的氧脂素中，前列腺素E2（PGE2）在衰老组中增加最多。基于这些观察，研究人员假设心房中持续的PGE2可能干扰Fto降解。为了验证这种可能性，用不同浓度的PGE2处理人iPSC-aCMs。随着PGE2暴露增加，FTO蛋白的免疫印迹水平随之增加，而KCNE1蛋白水平降低。使用qPCR验证了PGE2对FTO在转录水平的影响，发现PGE2处理后无差异。接下来使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂Bafilomycin A1进行了一系列研究，发现FTO蛋白稳定性受功能性泛素-蛋白酶体途径影响，而非自噬途径。此外，发现iPSC-aCMs中FTO的泛素化在PGE2处理下减弱，表明PGE2的存在抑制了此类细胞中FTO的泛素介导的蛋白酶体降解过程。受此启发，研究人员研究了小鼠心房中Fto泛素化水平，发现19月龄小鼠的泛素化水平低于2月龄小鼠。

4 讨论

尽管m⁶A修饰在多种生物过程中的作用已得到充分证明，但其在心肌细胞中的功能和分子调控，尤其是在衰老心肌细胞背景下的作用，仍知之甚少。本研究分析并比较了心房中的m⁶A表观转录组，并证明Fto诱导的衰老小鼠心房m⁶A修饰缺失是AF易感性的基础。值得注意的是，本研究取得了若干新发现。首先，发现Kcne1的CDS和3‘UTR区域在衰老小鼠心房中发生m⁶A去甲基化。其次，心肌细胞特异性Fto敲除的衰老小鼠在mRNA和蛋白水平上均表现出Kcne1上调，削弱了衰老诱导的APD₉₀缩短，并改变了AF易感性。将野生型Fto（而非其催化失活突变体）过表达到小鼠心肌细胞中，会降低心房Kcne1蛋白水平，导致APD₉₀缩短，增强I_Ks电流，并增加AF诱导性。第三，FTO介导的KCNE1 m⁶A去甲基化抑制KCNE1前体mRNA剪接、核输出以及KCNE1 mRNA的翻译效率。此外，证实AF患者LAA样本中的FTO蛋白水平随年龄增长而增加，并且这与KCNE1水平降低相关。

研究人员观察到19月龄小鼠心房中m⁶A和Kcne1蛋白水平降低，这与AF诱导性增强相关。KCNE1的表达不足以使心脏细胞产生电流电位，因为它需要与KCNQ1结合形成通道复合物以产生钾电流I_Ks。有文献记载，持续性AF患者的LA和右心房心肌细胞中I_Ks增加。此外，KCNQ1或KCNE1的突变通过增加复极化外向I_Ks电流和缩短心房APD导致家族性AF。也有报道称几种形式的KCNE1多态性与AF相关。支持本研究发现的是，先前的动物研究表明，Kcne1敲除小鼠通过增强心房心肌细胞中的复极化外向I_Ks电流，表现出频繁的自发性AF发作，但心脏结构正常。家兔右心房快速起搏1周后，Kcne1蛋白水平降低。沉默Kcne1诱导家兔心房心肌细胞I_Ks更大程度增加，并增强AF的诱导性和持续时间。研究人员进一步证实，通过AAV9进行心肌细胞特异性Kcne1敲低可促进I_Ks电流并增加小鼠的AF诱导性，而不影响心房结构。此外，通过过表达Kcne1，衰老诱导的心房心肌细胞I_Ks电流增强以及AF诱导性被显著逆转。重要的是，心脏中过表达Kcne1对衰老诱导的LA扩张和纤维化没有影响