老年斑马鱼自发性心脏瓣膜疾病模型：年龄相关性瓣膜退变的机制与功能研究

本文首次报道了老年斑马鱼（>2.5岁）作为人类心脏瓣膜病（VHD）的自发性动物模型，揭示了其瓣膜在体积、形态、细胞组成、细胞外基质（ECM）分布及免疫细胞浸润方面发生与人类VHD相似的退行性改变，并伴有心脏功能异常，为研究VHD的发病机制和药物筛选提供了宝贵的新型模型。

　　

引言

心脏瓣膜病（Valvular Heart Disease, VHD）是一种与年龄高度相关的普遍性心血管病理，影响着数百万人的健康。VHD主要包括瓣膜狭窄（Stenosis）和瓣膜关闭不全（Regurgitation）。前者常由瓣叶钙化引起瓣膜僵硬，后者则因瓣膜重塑导致血液反流。其中，主动脉瓣狭窄（Aortic Valve Stenosis, AVS）/钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease, CAVD）是导致最高住院率和死亡率的VHD类型。黏液瘤样二尖瓣退变/疾病（Myxomatous Mitral Valve Degeneration/Disease, MMVD）则表现为瓣叶增厚、松弛而非僵硬，其最常见并发症是黏液瘤样二尖瓣脱垂（Myxomatous Mitral Valve Prolapse, MMVP），常导致二尖瓣反流（Mitral Regurgitation），这是VHD最常见的形式。目前，VHD的治疗选择有限，缺乏有效的药物治疗，主要依靠瓣膜修复或置换手术。对VHD精确发病机制的理解受到自发性动物模型缺乏的限制，这同时也限制了新疗法的筛选和测试。斑马鱼因其遗传易操作性和与人类疾病相关基因的高度相似性，已成为研究人类疾病的重要模型。其心脏虽为两腔室，但细胞组成、心率和电传导与人类相似，心脏形态发生和瓣膜发育的机制在哺乳动物和斑马鱼之间是保守的。本研究旨在揭示自然衰老的斑马鱼是否会出现自发性瓣膜结构改变，并评估其与人类临床疾病的相似性。

结果

老年斑马鱼瓣膜的形态学变化

通过酸品红橙黄G（Acid Fuchsin Orange G, AFOG）染色组织切片分析，发现老年斑马鱼（>2.5岁）与年轻斑马鱼（<1.5岁）相比，房室瓣（Atrioventricular Valve, AV，类似于二尖瓣）和球室瓣（Bulboventricular Valve, BV，类似于主动脉瓣）均表现出更大的瓣膜体积、瓣叶最大宽度和面积。定性评分显示，严重的表型变化仅出现在老年鱼中（AV占42%，BV占38%），而年轻鱼中已有部分（AV 66%，BV 58%）出现轻度表型变化。老年鱼更常出现双瓣膜同时受累（70%）的情况。此外，老年心脏还表现出更多的心室间质纤维化。

三维形态计量学分析

利用组织透明化（Ce3D方法）和共聚焦显微镜成像，对完整瓣膜进行三维重建。分析发现，经心室面积标准化后，老年斑马鱼的AV和BV总体积均显著大于年轻斑马鱼，其中AV的增大更为明显。对单个瓣叶的分析显示，BV的两个瓣叶在老年鱼中均同样受累，而AV中仅主要瓣叶（Major Leaflets, MaL）体积显著增加，次要瓣叶（Minor Leaflets, miL）变化不显著，表明AV的主要瓣叶更易受衰老影响。

瓣膜表型分析

年轻斑马鱼瓣膜细胞排列有序，而老年鱼瓣膜常出现结构紊乱、结节状区域和囊性变，细胞密度降低。利用内皮细胞标记转基因系Tg(fli1:EGFP)分析发现，年轻鱼瓣叶表面覆盖着一层均匀紧密的瓣膜内皮细胞（Valvular Endothelial Cells, VECs），而老年鱼AV的VECs层GFP表达减少，BV的VECs层不均匀并出现间隙，提示内皮功能紊乱。Russell-Movat五色染色（Russel-Movat's Pentachrome, RMP）显示，老年鱼AV中的弹性蛋白层增厚且紊乱，定量分析表明AV中弹性蛋白含量显著高于年轻鱼，这与人类二尖瓣脱垂（Mitral Valve Prolapse, MVP）临床观察相似。BV的弹性蛋白含量在年轻和老年鱼间无显著差异，但变异性较大。

胶原分布与成骨分化

免疫荧光分析显示，胶原I（Collagen I）主要分布在AV瓣叶的锚定结构和心室面。老年鱼AV的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）呈现无序状态，并出现缺乏胶原的囊性区域。利用Tg(sp7:mCherry)转基因鱼（Sp7/Osterix是成骨细胞分化的标志物）进行研究，发现在老年鱼AV和BV的瓣叶基部和尖端存在mCherry阳性细胞，这些细胞多位于瓣叶表面，提示VECs可能发生了向内皮来源的瓣膜间质细胞（Endothelial-derived Valvular Interstitial Cells）或成骨性瓣膜间质细胞（Osteoblastic VICs）的转分化。定量分析显示，老年鱼瓣膜内Sp7阳性区域面积显著大于年轻鱼。

免疫细胞浸润

利用全白细胞标记物L-塑形蛋白（L-plastin）和巨噬细胞标记转基因系Tg(mpeg1.1:mCherry)分析免疫细胞浸润。三维渲染显示，老年鱼AV和BV内的mpeg1.1阳性细胞数量显著高于年轻鱼，尤其在BV中增加最为明显。L-塑形蛋白阳性细胞数量也增加，且多于mpeg1.1阳性细胞，提示除巨噬细胞外还有其他白细胞亚型浸润。这些免疫细胞常位于瓣叶心房面/心室面靠近血流处。

心脏功能评估

通过彩色多普勒和脉冲波多普勒（Pulsed Wave Doppler, PWD）超声心动图评估心脏功能。彩色多普勒显示，反流（Regurgitation）在年轻和老年鱼中均常见，且AV发生率高于BV，但反流发生率在年龄组间无差异。然而，老年鱼AV的反流分数（反流血流占最大血流比例）显著高于年轻鱼，表明瓣膜关闭功能受损。BV的反流分数在年龄组间无差异。血流面积测量显示，老年鱼通过BV的流出道面积显著小于年轻鱼。脉冲波多普勒分析心室流入道参数（E波、A波速度和E/A比值）在年龄组间无显著差异。然而，所有心室流出道参数，包括速度时间积分（Velocity Time Integral, VTI）、平均和峰值压力梯度、平均和峰值流速，在老年鱼中均显著降低，表明老年鱼心室收缩功能及BV功能发生特异性改变。

讨论

本研究描述了野生型老年斑马鱼中自发的瓣膜异常表型和心脏功能障碍。绝大多数超过2.5岁的斑马鱼在AV和BV均表现出某种形式的瓣叶增厚，并伴有病理改变。瓣叶增厚是临床VHD的常见表型。三维重建证实了瓣膜体积的增加。值得注意的是，超过一半的年轻对照组斑马鱼（11-13月龄）已表现出轻度表型变化，提示这可能是一种随时间进展的疾病。本研究的超声心动图评估未发现年龄组内存在性别差异。

表型研究提示老年斑马鱼的瓣膜异常表现为混合性病理。AV的囊性、结节状区域和细胞密度降低类似于黏液瘤样退行性VHD，且AV体积变化最显著。而BV则表现出最显著的瓣叶厚度变化、炎症浸润和血流动力学改变。同时观察到的VECs覆盖改变和Sp7/Osterix表达，则是AVS的特征性病理。大多数老年鱼（70%）双瓣膜同时受累，提示其病因可能相互关联。

功能评估表明，反流在年轻和老年鱼中均普遍存在，且更常见于AV，但反流发生率无年龄差异。然而，老年鱼AV的反流分数更高，说明观察到的瓣膜表型影响了AV的关闭功能。血流动力学变化主要体现在与BV功能和流出道相关的参数上，老年鱼血流通过BV时减少，且流出道面积减小，提示收缩功能缺陷。心室间质纤维化也可能参与其中。VTI的降低是心力衰竭严重程度的预后指标。

免疫细胞研究表明，老年鱼瓣膜内免疫细胞数量增加，且涉及多种白细胞亚型。免疫细胞浸润在AVS和退行性瓣膜病中均是已知的驱动因素。

材料与方法

使用转基因斑马鱼系Tg(mpeg1.1:mCherry)、Tg(fli1:EGFP)和Tg(sp7:mCherry)。年轻鱼定义为<1.5岁，老年鱼为2.6-3.5岁。采用标准程序进行组织学染色（AFOG, RMP, Masson's Trichrome）、免疫荧光染色、Ce3D组织透明化、共聚焦显微镜成像和超声心动图检查（彩色多普勒、脉冲波多普勒）。图像分析使用Fiji软件，三维渲染使用自定义的Modular Image Analysis (MIA)插件。统计分析使用GraphPad Prism软件，根据数据分布情况选择参数检验（Welch's t检验）或非参数检验（Mann-Whitney U检验）。

作者贡献与致谢

L.B., J.R., H.U., J.C., A.E. 设计并执行实验；S.C. 开发定制软件；M.H. 提供专家建议；R.J.R. 设计项目并监督工作。所有作者参与撰写和审阅手稿。感谢Wolfson生物成像设施和水族馆设施团队的支持，以及Chrissy Hammond教授和Erika Kague博士分享Tg(sp7:mCherry)鱼系。

利益冲突

作者声明无利益冲突。