IRE1-XBP1s内质网应激通路通过调控细胞增殖维持年轻表皮基底层稳态

本研究首次在短寿命脊椎动物非洲青鳉（Nothobranchius furzeri）模型中揭示IRE1-XBP1s内质网应激（ER stress）通路在表皮衰老中的双重作用：年轻时期通过葡萄糖代谢激活Vcp维持基底层细胞增殖，而年龄相关糖代谢下降导致该通路失活，进而加速皮肤老化。该发现为干预皮肤衰老提供了新靶点。

　　

1 引言

在多细胞生物中，干细胞通过增殖维持组织完整性。特别是在皮肤这一保护机体免受外界侵害的复层上皮中，表皮基底层的干细胞通过自我更新在持续细胞更新和伤口修复中发挥关键作用。衰老过程中，表皮干细胞经历耗竭并丧失增殖能力，导致其维持组织稳态和修复受损组织的能力下降。尽管对表皮干细胞活性及皮肤衰老的调控机制已有广泛研究，但细胞内在信号变化如何影响衰老过程中的细胞增殖尚不清楚。

除干细胞耗竭外，蛋白稳态（proteostasis）丧失是组织衰老的标志之一。蛋白稳态是指通过监督蛋白质合成、确保蛋白质质量控制以及采用适应性机制来减轻未折叠和错误折叠蛋白质积累，从而防止异常蛋白质聚集并支持组织稳态的系统。泛素-蛋白酶体和溶酶体-自噬系统是维持蛋白稳态的主要参与者，通过蛋白水解消除细胞内的未折叠蛋白，且两者活性均随衰老而下降。除胞质蛋白稳态外，内质网（ER）应激反应系统也参与细胞器内的蛋白稳态。内质网在约三分之一细胞蛋白质组的合成和正确折叠中起核心作用。在缺氧、营养剥夺、蛋白质氧化增加或分泌途径中断等条件下，内质网可能过度积累错误折叠蛋白，导致内质网应激（ER stress）。内质网应激激活三条经典通路以防止错误折叠蛋白积累：肌醇需求酶1（Ire1）-X盒结合蛋白1（Xbp1）通路、PKR样内质网激酶（Perk）-激活转录因子4（Atf4）通路以及激活转录因子6（Atf6）通路。在Ire1-Xbp1s通路中，内质网应激刺激Ire1二聚化及随后的反式自磷酸化，从而促进Ire1的RNase活性。活化的Ire1从Xbp1 mRNA中剪接出一个26核苷酸的内含子，产生转录因子Xbp1s（剪接型Xbp1）。Xbp1s刺激与蛋白质折叠和质量控制机制相关的一组基因的表达。

既往在模式生物中的研究揭示了衰老过程中内质网应激反应活性的改变。在线虫（C. elegans）中，响应内质网应激药理诱导剂的能力随年龄增长而丧失；而在果蝇（Drosophila）肠道中，Ire1-Xbp1s通路在衰老过程中被激活，导致衰老肠道细胞异常增殖。数项小鼠研究表明，内质网应激反应在衰老过程中被激活。与年轻成年小鼠相比，老年小鼠骨细胞中Atf4和Xbp1s水平升高。类似地，老年小鼠脂肪基质细胞显示Atf6和磷酸化Ire1水平升高。这些结果表明，内质网应激及其反应通路随年龄增长而失调，并与组织衰老进程相关。内质网应激反应的变化被认为与衰老进程相关，但这些变化如何影响脊椎动物衰老过程仍知之甚少，部分原因是年龄依赖性内质网应激反应改变仅在有限器官和细胞中得到检验。为揭示此问题，分析整个脊椎动物生命周期内内质网应激反应的动态和角色将是有效的。然而，常规脊椎动物模型（小鼠和斑马鱼寿命约为3年）的长寿命阻碍了我们的理解。为克服此障碍，我们利用非洲青鳉（Nothobranchius furzeri），一种寿命极短（数月）的小型脊椎动物，来研究衰老过程中内质网应激反应活性的空间动态和角色。

2 结果

2.1 N. furzeri中Ire1-Xbp1s活性的年龄依赖性变化

为检验衰老过程中发生的内质网应激反应变化，我们聚焦于Ire1-Xbp1s通路，这是内质网应激反应中最保守和特异的通路。我们首先确认N. furzeri的xbp1转录本的26核苷酸内含子被剪接掉，类似于斑马鱼、小鼠和人类的xbp1，并且衣霉素（tunicamycin，一种特异性诱导内质网腔内未折叠蛋白积累的药理内质网应激诱导剂）处理促进了N. furzeri胚胎中xbp1s的产生，表明Ire1-Xbp1s内质网应激反应通路在N. furzeri中起作用。为评估Ire1-Xbp1s活性的年龄依赖性变化，我们检测了年轻（1.2月）和老年（4.2月）鱼肝脏、皮肤、心脏、大脑、肠道和肌肉中xbp1s mRNA的表达水平。与先前小鼠研究一致，xbp1s表达在大多数老年组织中上调，包括肝脏和心脏。为进一步检查内质网应激反应活性的时空动态，我们通过Tol2转座酶介导的转基因技术将Xbp1s-EGFP报告基因引入N. furzeri。该报告基因通过内源性Ire1依赖性剪接响应内质网应激表达截短的Xbp1s-EGFP融合蛋白。我们通过两次与野生型N. furzeri回交获得了携带单拷贝转基因的稳定品系。为测试报告基因的特异性，我们用衣霉素和Ire1抑制剂4μ8C处理转基因胚胎。正如预期，衣霉素激活了报告基因表达，但4μ8C共处理阻断了此激活，表明报告基因特异性反映Ire1-Xbp1s活性。

接下来，我们尝试使用Xbp1s-EGFP报告基因检测N. furzeri中Ire1-Xbp1s活性的年龄依赖性空间变化。与qPCR结果一致，肝脏和心脏中GFP阳性细胞数量随年龄增加。在老年肝脏中，xbp1s mRNA表达上调最为显著，同时观察到未折叠蛋白聚集以及内质网形状和大小改变（这些是内质网应激的迹象），表明衰老过程中肝脏可能积累内质网应激。此外，编码伴侣蛋白（hspa5和hsp90b1）、内质网相关降解机制蛋白（edem1和derl1）、内质网氧化酶（ero1）以及细胞周期停滞和凋亡诱导转录因子（ddit3）的内质网应激反应靶基因的表达水平在老年肝脏中相对高于年轻鱼。这些结果提示，慢性内质网应激发生在老年肝脏中，与先前小鼠肝脏中的观察一致。

2.2 Ire1-Xbp1s活性驱动年轻表皮细胞增殖

与肝脏和心脏类似，Xbp1s-EGFP阳性细胞在衰老过程中也在表皮中增加。一致地，FK1（多聚泛素单抗）阳性焦点在老年表皮中增加，提示老年表皮中未折叠蛋白积累。相比之下，在年轻鱼的表皮基底层检测到强烈的报告基因活性，该活性随年龄增长显著下调。另一方面，在年轻和老年鱼的表皮基底层均未检测到泛素化蛋白增加，表明年轻表皮基底层中Ire1-Xbp1s的强烈激活可能独立于未折叠蛋白积累。此外，我们观察到老年小鼠表皮基底层中Ser-724位点磷酸化的IRE1（Ire1活性的指标）减少，提示Ire1-Xbp1s通路在哺乳动物表皮基底层中也随衰老而衰退。由于表皮基底层由表皮干细胞和祖细胞组成，我们推测Ire1-Xbp1s活性或内质网应激本身可能参与调控基底层增殖。既往在人类和小鼠中的研究表明，包括干细胞在内的细胞增殖在衰老表皮中减少。尽管标记有p63的角质形成细胞干细胞和祖细胞在年轻和老年N. furzeri皮肤中均被检测到且数量不随年龄改变，但PCNA（增殖标记物）和p63双阳性细胞随年龄减少，表明N. furzeri中也发生年龄依赖性表皮细胞增殖下降。为测试内质网应激是否影响细胞增殖，用衣霉素处理老年鱼。衣霉素瞬时处理增加了老年表皮基底层中PCNA阳性细胞的数量。我们还证实衣霉素诱导了老年N. furzeri皮肤中内源性xbp1s mRNA水平、内质网应激反应靶基因（hspa5和hsp90b1）以及Xbp1s-EGFP报告基因活性的表达，而泛素化蛋白水平、细胞死亡和细胞粘附连接未见显著变化，提示内质网应激反应的瞬时激活未对表皮细胞造成进一步损害。值得注意的是，基于PCNA阳性细胞计数，衣霉素处理也显示出年轻表皮基底层细胞增殖增加的趋势。总之，这些结果表明表皮基底层中高的内质网应激反应驱动细胞增殖，而强制激活内质网应激可使老年表皮中的基底层活性恢复年轻。

为进一步确认Ire1-Xbp1s活性参与表皮细胞增殖，我们使用三重靶向CRISPR-Cas9方法敲除编码Ire1受体的基因，该方法能够通过单基因破坏有效产生全身双等位基因敲除并在F0代检验基因功能。先前在青鳉（Oryzias latipes）中的研究表明，需要同时缺失Ire1α和Ire1β才能抑制xbp1剪接。因此，我们在N. furzeri中敲除了Ire1α和Ire1β（分别由ern1和ern2基因编码），并确认KO胚胎中ern1和ern2的表达被抑制。正如预期，Ire1α/β KO减少了年轻鱼中PCNA阳性细胞的数量，提示Ire1有助于表皮细胞增殖。为进一步验证此假设，我们使用了表达祖细胞标记物p63的年轻N. furzeri皮肤来源的表皮培养细胞。与体内结果一致，衣霉素处理增加了N. furzeri皮肤培养细胞的增殖能力，而使用特异性Ire1化学抑制剂4μ8C处理则以剂量依赖性方式降低了其增殖能力，且未诱导细胞死亡。 collectively，这些数据表明Ire1-Xbp1s活性参与细胞增殖。此外，4μ8C处理也降低了人角质形成细胞PHK-160b的增殖，提示Ire1-Xbp1s通路介导的表皮细胞增殖在人类中是保守的。

有趣的是，在年轻N. furzeri的大脑中脑增殖区和增殖性肠隐窝中也检测到强烈的Xbp1s-GFP报告基因活性，提示Ire1-Xbp1s活性可能有助于多种年轻组织（包括大脑和肠道）中的细胞增殖。

2.3 内质网应激使老年表皮细胞增殖的转录组模式年轻化

为阐明Ire1-Xbp1s通路被调控并控制表皮细胞增殖的机制，我们使用光隔离化学（PIC）技术对年轻、老年和衣霉素处理的老年（老年Tm）表皮p63阳性细胞进行了空间转录组分析。PIC使用光敏探针，能够特异性从光照射的感兴趣区域确定基因表达谱。来自PC1和PC2的PCA分析显示老年Tm与年轻和老年转录组模式之间存在鲜明对比，这是由预期的应激反应升高引起的。然而，来自PC2和PC3的PCA分析显示，某些基因组的转录组模式在年轻和老年表皮基底层之间存在明显差异，而衣霉素处理部分地将老年模式恢复至年轻状态。这些结果表明，强制激活内质网应激可以部分地使老年表皮基底层的转录组模式年轻化。这个年轻化的组包括与细胞周期进程（top2、cdk4、cdk7和eif4）和内质网应激反应（atf4、hsp90b1、pfdn2和ddit3）相关的基因，这些基因随年龄下调但在老年Tm样本中上调。通路分析也表明衣霉素处理激活了老年基底层中与内质网中蛋白质加工和细胞周期相关的基因表达。这些表达模式的变化与我们观察到的Ire1-Xbp1s活性和表皮细胞增殖随衰老下调，而年龄依赖性下调被衣霉素处理逆转相一致。值得注意的是，我们的PIC分析还表明，年龄依赖性的hnrnpu下调和map-Semaphorin（plxna2、sema6dl和sema3ab）及Notch信号（dll4）相关基因的上调被强制内质网应激激活所逆转。一致地，小鼠中hnrnpu的下调导致表皮变薄、皮肤脆性和分化失调，而Plexin-Semaphorin信号和Notch信号的激活负向调控表皮细胞增殖。这些结果表明，年龄依赖性的hnrnpu表达减少和Plexin-Semaphorin及Notch信号的激活会促进N. furzeri表皮衰老。总之，我们的PIC分析揭示了N. furzeri表皮基底层中年龄依赖性转录组模式变化，以及内质网应激使老年表皮基底层的多种活性年轻化。

2.4 Ire1-Xbp1s通过Vcp促进表皮细胞增殖

在年轻化基因群中，我们聚焦于含缬酪肽蛋白（Vcp），一种进化上保守的ATP酶，作为Ire1-Xbp1s依赖性增殖的候选介质，因为Vcp通过靶向CDK抑制剂p27的核输出和降解正向调控细胞周期G1期向S期过渡，并且也参与内质网相关降解（ERAD）的调控，这是内质网应激反应的下游过程。一致地，人类年龄相关基因表达数据库voyAGEr显示vcp和几个内质网应激反应相关基因在人类耻骨上皮肤中随年龄下调。为检验Vcp活性是否参与表皮细胞增殖，我们用NMS-873（一种特异性Vcp抑制剂）处理年轻鱼，发现NMS-873处理减少了表皮PCNA阳性细胞的数量。此外，NMS-873处理也以浓度依赖性方式降低了N. furzeri皮肤培养细胞和人角质形成细胞的增殖。而且，当与NMS-873共处理时，衣霉素诱导的N. furzeri皮肤培养细胞增殖被显著减弱，提示Ire1-Xbp1s以Vcp活性依赖性方式驱动表皮细胞增殖。

2.5 葡萄糖激活年轻表皮基底层中的Ire1-Xbp1s

PIC数据还表明，与糖酵解相关的基因，包括aldoaa、gapdh、pgam2和eno3，随年龄下调。此外，糖酵解产物乳酸在老年皮肤中显著减少，伴随葡萄糖积累，提示老年表皮细胞代谢葡萄糖能力降低和整体糖酵解衰退。先前在胰腺β细胞中的研究表明，当用葡萄糖（糖酵解的前体）处理时，Ire1-Xbp1s被激活。因此，我们研究了葡萄糖是否可以通过糖酵解诱导Ire1-Xbp1s活性。与此一致，我们发现葡萄糖处理诱导了N. furzeri皮肤细胞中的Ire1-Xbp1s活性和增殖，而使用4μ8C抑制Ire1则抑制了葡萄糖依赖的增殖效应。这些发现表明Ire1-Xbp1s通路被葡萄糖激活，并且年龄依赖性葡萄糖代谢下调可能因此降低Ire1-Xbp1s活性和表皮基底层的细胞增殖。

3 讨论

我们利用N. furzeri和人类细胞培养揭示了内质网应激反应通路在调控表皮组织稳态和衰老中的衰老相关动态及意外作用。既往研究报道，年龄依赖性未折叠蛋白积累介导的内质网应激和内质网应激反应的持续激活与多种衰老相关疾病相关。与这些观察一致，我们的qPCR和报告基因分析揭示，内质网应激反应Ire1-Xbp1s通路在N. furzeri的多种组织（包括肝脏和心脏）中随年龄上调。令人惊讶的是，Ire1-Xbp1s在年轻N. furzeri表皮基底层中高度激活并随衰老下调。在年轻皮肤中，Ire1-Xbp1s通路通过激活细胞周期调节因子Vcp维持细胞增殖。表皮基底层中Ire1-Xbp1s的激活由葡萄糖代谢驱动，后者也在衰老过程中衰退。葡萄糖-Ire1-Xbp1s-VCP轴也正向调控人类皮肤细胞培养物的增殖。这些结果表明内质网应激可能通过维持其增殖活性来控制表皮细胞衰老。

内质网应激一直被认为是有害的；然而，其有益影响尚不清楚。此外，对Ire1-Xbp1s的研究集中于其作为对抗错误折叠蛋白聚集应激的适应性机制的作用；然而，其其他功能仍不清楚。尽管近期研究表明Ire1-Xbp1s通路可在体外促进癌细胞增殖，并在小鼠受损肌肉中促进卫星细胞增殖，且药理学激活内质网应激在体外刺激β细胞增殖，但连接内质网应激反应和细胞增殖的机制仍不清楚。我们的报告基因和空间转录组分析揭示了内质网应激信号通过Ire1-Xbp1s在正向调控表皮细胞增殖以维持皮肤稳态中的先前未被认识的作用。我们还证明Ire1-Xbp1s活性的年龄依赖性下调与表皮基底层中的衰老表型相关，而先前研究提出内质网应激反应的年龄依赖性上调是衰老的驱动因素。

此外，我们通过药理学激活内质网应激成功再激活了老年皮肤表皮细胞。众所周知，机体衰老受周围环境刺激影响，包括细胞应激。既往对线虫的研究表明，幼虫期的氧化应激可能诱导一种激效状态，增强应激抵抗和寿命。类似地，内质网应激反应最近被证明调控人类造血干细胞中的细胞反应，其中在内质网应激下，人类造血HSCs上调促生存的Ire1-Xbp1s分支以存活。这表明适度的内质网应激信号和Ire1-Xbp1s通路的具体激活可能有益于维持组织稳态。此外，我们在年轻表皮基底层中未检测到胞质泛素化，提示年轻表皮基底层中强烈的Ire1-Xbp1s活性可能独立于未折叠蛋白；然而，同样重要的是注意到Ire1-Xbp1s的激活在某种程度上可能减少未折叠蛋白的积累。

有趣的是，年轻大脑中脑区也显示出强烈的Ire1-Xbp1s活性，该活性随年龄衰退，提示Ire1-Xbp1s活性可能有助于维持表皮基底层的年轻状态，并且这种衰退不仅驱动皮肤衰老，也驱动其他组织衰老。相比之下，肠隐窝Ire1-Xbp1s活性倾向于随年龄增加。老年N. furzeri肠隐窝中Ire1-Xbp1s活性的增加可能指示异常细胞增殖，类似于果蝇肠道中的发现，其中Ire1-Xbp1s通路在衰老过程中上调导致异常肠道细胞增殖。需要进一步研究各种组织以更好地理解Ire1-Xbp1s通路介导的细胞增殖控制在组织稳态中的作用和意义。

新型空间转录组学方法PIC的应用使得能够分析N. furzeri表皮基底层的特异性转录组，并鉴定葡萄糖代谢和Vcp分别作为Ire1-Xbp1s通路上游和下游介质在表皮细胞增殖中的作用。Vcp作为细胞周期和癌症进展的正向调节因子已被充分研究；然而，其在组织稳态和细胞增殖中的作用和调控知之甚少。本研究揭示Vcp活性对于Ire1-Xbp1s介导的N. furzeri表皮细胞增殖是必需的。值得注意的是，Vcp也是内质网应激反应期间蛋白质降解的已知介质。在年轻皮肤表皮基底层中，Vcp可能不仅在细胞周期控制中起作用，而且在下游Ire1-Xbp1s内质网应激反应中起到保护免受蛋白毒性损伤的作用。

数项研究报道降低的葡萄糖代谢与衰老表型相关。例如，在果蝇中，衰老导致肌肉和大脑中糖酵解基因表达减少，而强制表达糖酵解基因延长健康寿命。糖酵解在老年人类大脑和老年小鼠内皮细胞中也受损。在本研究中，我们显示葡萄糖通过激活Ire1-Xbp1s通路促进N. furzeri表皮细胞增殖，并且年龄依赖性葡萄糖代谢减少可能下调Ire1-Xbp1s通路以促进N. furzeri表皮细胞衰老。尽管在胰腺β细胞中也观察到葡萄糖依赖性Ire1-Xbp1s激活，但葡萄糖如何通过其代谢刺激Ire1-Xbp1s仍不清楚。一项对肝癌细胞的研究提示，三羧酸（TCA）循环（葡萄糖下游的代谢途径）可能通过Idh2介导的线粒体NADPH产生和谷胱甘肽氧化还原刺激内质网应激，表明葡萄糖可能通过N. furzeri皮肤中的这种TCA循环介导机制激活Ire1-Xbp1s活性。先前一项研究也显示，通过敲除Ldh（一种产生乳酸的酶）抑制乳酸产生会抑制毛囊中的干细胞增殖，提示糖酵解产生的乳酸或其他相关代谢物的增加对于干细胞激活是必需的。因此，乳酸或其他Ldh相关代谢物也可能参与内质网应激介导的表皮细胞激活。需要进一步阐明细胞代谢与内质网应激反应之间的关系以揭示表皮细胞增殖衰退的原因。

重要的是，人类公共数据也显示人类皮肤中内质网应激反应相关基因、Vcp和糖酵解相关基因的表达存在年龄依赖性减少，类似于N. furzeri。这些发现提示葡萄糖-Ire1-Xbp1s-Vcp轴可能有助于维持和调控年轻人类表皮细胞的年轻状态及衰老。进一步理解Ire1-Xbp1s活性在哺乳动物和人类表皮干细胞中的作用和调控可能导致发现促进人类健康皮肤衰老的有前景的治疗策略。