单细胞RNA测序揭示共生菌群在食管癌多阶段发展中的作用机制

本研究通过单细胞RNA测序技术，首次系统解析了食管共生菌群在4-NQO诱导的小鼠食管鳞癌（ESCC）多阶段演进过程中的动态作用。研究发现菌群通过促进上皮细胞恶性转化和炎症性成纤维细胞（FibC4）形成，塑造慢性炎症微环境；而抗生素清除菌群（ABX组）虽降低炎症反应，却增强调节性Cd4+T细胞（Treg）浸润和成纤维细胞-Treg互作，最终加剧免疫抑制并促进侵袭性癌变。该研究为菌群调控ESCC发病机制提供了单细胞水平的证据，提示靶向菌群微环境互作可能成为ESCC防治新策略。

　　

引言

食管癌是全球发病率第七、死亡率第六的恶性肿瘤，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）约占90%。ESCC的发生发展是多阶段过程，包括炎症（INF）、不典型增生（DYS）、原位癌（CIS）和浸润性癌（ICA）。肿瘤微环境（TME）中的微生物组与癌症进展密切相关，但其在ESCC发病机制中的具体作用尚不明确。本研究利用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）诱导的小鼠自发性ESCC模型，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和宿主-微生物互作单细胞分析（SAHMI），系统阐述了食管共生菌群在ESCC多阶段演进中的调控作用。

材料与方法

研究采用4周龄雄性C57BL/6小鼠，通过饮用水添加抗生素混合物（ABX：万古霉素、新霉素、普利玛辛）清除食管共生菌群，对照组（H₂O组）饮用普通水。两组小鼠均接受12周100μg/mL 4-NQO处理诱导ESCC癌变，分别在0、12、22、28周采集食管黏膜进行scRNA-seq、scTCR-seq和16S rDNA测序。数据分析采用Seurat、Harmony、SAHMI、InferCNV、scVelo、GSVA和CellChat等生物信息学工具。

结果

病理分期与菌群变化

16S rDNA测序证实ABX组食管菌群α多样性和β多样性显著低于H₂O组。28周时ABX组浸润性癌比例和死亡率均显著高于H₂O组，表明菌群失调影响ESCC进展。

细胞图谱与菌群分布

54,562个细胞的scRNA-seq鉴定出10个主要细胞类型。菌群定植细胞比例在H₂O组达30%-45%，ABX组显著降低。上皮细胞菌群定植率最高，且肿瘤上皮细胞定植率高于正常上皮细胞。炎症通路（IL6-JAK-STAT3、TNFA-NFKB）在H₂O组持续激活，而ABX组TGF-β通路优势明显，提示菌群缺失使微环境由炎症向免疫抑制转变。

上皮细胞恶性转化

InferCNV分析显示染色体异常从INF阶段开始积累，肿瘤上皮细胞线粒体基因（mt-Nd1、mt-Atp6）和癌基因Malat1表达上调。菌群定植与CNV评分正相关（R=0.49），但ABX处理不影响肿瘤细胞比例，说明菌群通过微环境而非基因组不稳定性促进癌变。

炎症性成纤维细胞形成

成纤维细胞分为4个亚群：正常型（FibC1）、祖细胞样（FibC2）、增殖型（FibC3）和炎症型（FibC4）。FibC4高表达补体成分（C3、C4b）、趋化因子（Cxcl1、Ccl2）和IL6，在H₂O组DYS/ICA阶段显著扩增。scVelo分析显示菌群促进FibC2向FibC4分化，mfIHC证实ABX组LPS⁺Dcn⁺C3⁺炎症性成纤维细胞减少。

T细胞亚群重塑

Cd4⁺T细胞中，调节性T细胞（Treg）在ABX组DYS/ICA阶段比例升高，且克隆扩增增强。Cd8⁺T细胞中，组织驻留记忆样耗竭T细胞（Cd8⁺ Trm-like Tex）在ABX组优势扩增但功能耗竭。菌群定植在Treg中显著富集，可能通过短链脂肪酸等机制促进其分化。

单核/巨噬细胞转化

髓系细胞中，抗菌巨噬细胞（Mo/MφC1，高表达Retnla、Lyz1）在H₂O组DYS/ICA阶段增加，而ABX组其由组织驻留巨噬细胞（Mo/MφC0）和单核样巨噬细胞（Mo/MφC4）的分化受阻。菌群定植主要影响DC和Mo/MφC1。

细胞间通讯网络

CellChat分析显示成纤维细胞是主要信号发送者。H₂O组中FibC4通过Ccl7-Ccr1、C3-C3ar1等通路与Mo/MφC1互作；ABX组则增强FibC4与Treg间的Ccl2-Ccr2、胶原蛋白-Cd44互作，驱动免疫抑制微环境形成。

讨论

本研究揭示食管共生菌群通过调控上皮-基质-免疫三方向互作影响ESCC演进。菌群存在时促进慢性炎症微环境，而菌群缺失虽减轻炎症，却通过增强FibC4-Treg互作诱导免疫抑制，最终加速肿瘤进展。该发现为理解菌群在ESCC中的作用提供了单细胞分辨率证据，提示精准调控菌群微环境可能成为ESCC防治新方向。未来需在人类ESCC中验证小鼠模型发现，并深入探索菌群调控关键细胞亚群分化的分子机制。

作者贡献

谢煊和张书月为共同第一作者，分别负责课题设计、数据分析和论文撰写；麦子航参与数据计算；韩菁和温静为通讯作者，负责课题设计、资源协调和论文修订。

伦理声明

本研究经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准（批号：L102012020030I）。