热胁迫的跨代效应：烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫期热应激对未来繁殖与子代发育的深远影响

本研究发现，烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫在发育晚期（5龄）遭受热胁迫（HS）会严重损害其成虫繁殖能力，导致卵孵化完全失败；而早期（3龄）热胁迫虽对成虫表型有负面影响，但未显著影响繁殖力。研究进一步揭示，亲代经历早期热应激可显著加速子代幼虫发育进程，展现出跨代可塑性（transgenerational plasticity）。该研究强调了发育阶段特异性热敏感窗口的重要性，为评估气候变化对昆虫种群适合度（fitness）的跨代累积效应提供了关键实验证据。

　　

1 引言

温度对生物体表现与适合度的作用通常仅在成虫热环境中被考量，然而早期发育阶段遭受的热胁迫可能产生持续效应，影响同一世代内的成虫性状，甚至跨越世代。本研究以烟草天蛾（Manduca sexta）这一研究昆虫发育、生理与热生物学的经典模式系统，探讨幼虫发育不同时期经历亚致死热休克（heat shock, HS）对成虫表现与适合度性状的 within-generation 效应，以及亲代热经历是否引发子代性状的可塑性变化（plastic changes）。

既往研究表明，外温动物（ectotherms）的性能与适合度随热环境变化显著，温度强烈影响生理速率过程（如摄食与代谢率）、生活史性状（如成熟年龄与体型）及适合度（存活与繁殖）。尽管不同生命阶段的热敏感性存在差异已被广泛记录，但热暴露在某阶段是否导致生命阶段间或甚至跨代的持久影响，却较少受到关注。幼虫期经历高温条件可能影响跨越变态边界（metamorphic boundary）的生理与发育，进而影响成虫性状。在昆虫中，前成虫阶段暴露于高但亚致死温度可能导致负面的适合度与表现后果，包括受损的发育与形态，以及降低的寿命与繁殖力（fecundity）。然而，不同研究间存在相当变异，可能与热胁迫的处理条件（如强度或时机）有关。

热敏感性可能因先前的热暴露而改变（即热可塑性，thermal plasticity）。许多昆虫实证研究记录了热可驯化（acclimation）的正面效应，如提高热耐受性与改善后续温度胁迫下的存活。但热可塑性并非总是有益，例如，促进短期暴露驯化的温度可能对更长期或重复暴露产生负面影响。热可塑性的能力在生命阶段间也可能不同，且可能在某些性状受益的同时，导致其他性状的权衡（trade-offs），如繁殖减少。

多数热可塑性研究聚焦于 within-generation 效应，但跨代的热暴露也能对生物体产生可测量的影响。亲代可能通过一系列非遗传或表观遗传过程改变其后代表型，包括母体效应（maternal effects）（如后代供给与照料）以及表观遗传传递（如RNA介导的修饰、表观遗传标记与DNA甲基化）。这些过程可被环境改变，为亲代环境影响子代表现提供潜在机制。跨代效应（又称亲代效应，parental effects）的强度对某些性状可能与 within-generation 效应相当。

本研究通过两代实验，具体探究：（1）亚致死热应激时机（幼虫早期或晚期）如何改变成虫繁殖性状；（2）亲代在 distinct 幼虫阶段经历的热胁迫能否在其子代于类似热环境中引发可塑性变化。

2 方法

2.1 研究系统

烟草天蛾（Manduca sexta）是研究昆虫发育、生理与热生物学的成熟模式系统。幼虫通常有5个龄期，超过90%的幼虫生长（质量增加）发生在最后两个龄期。预蛹幼虫（即漫游者，wanderers）钻入土壤化蛹，然后羽化为成虫鹰蛾。实验动物取自北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）的实验室种群，该种群自1980年代以来在UNC维持超过250代，未从外部种群添加个体。

2.2 实验设计

采用因子实验设计，跨越两代M. sexta。两代幼虫均在25°C ± 10°C的昼夜波动温度条件下饲养。子集幼虫在3龄（早期）或5龄（晚期）暴露于42°C的24小时热休克，产生三种热休克（HS）处理（N = 无热休克，E = 早期HS，L = 晚期HS）。幼虫饲养至羽化，同一热处理组内的成虫成对繁殖。亲代产生的卵用于建立F1代。

温度处理在环境培养箱中进行，光周期14L:10D。42°C热休克处理在单独培养箱中进行。这些实验热条件选择是因为M. sexta幼虫在25°C ± 10°C条件下生长迅速且存活率高，42°C接近幼虫上限致死温度44°C–45°C，因此这些热休克应导致一些但非高死亡率。

2.3 数据收集

从3龄开始，记录每个个体的存活、年龄（天）与质量（mg），在每个幼虫龄期开始时、漫游时、蛹期15天时以及羽化日（翅膀完全干燥后测量）。为量化热休克期间的质量变化，所有个体在进入及结束24小时热休克事件时均评估质量。蛹期确定存活个体的性别。通过收集并计数每个网笼中单雌产卵数来量化蛾的繁殖力（fecundity）。这些卵保持在25°C并每日检查以确定孵化数。成虫寿命从羽化日期计算至死亡日期。

为确定热休克是否影响卵大小，每天从所有蛾对收集的卵子集在显微镜相机下拍摄（带校准幻灯片），使用Fiji估计卵面积（mm²）。

2.4 统计分析

所有统计分析在R（版本4.0.2）中进行。亲代（P）与子代（F1）世代分开分析。羽化存活使用广义线性模型（二项分布）评估。成虫发育时间、羽化质量、成虫寿命与繁殖力测量使用线性混合效应模型建模。热休克期间质量变化与卵大小也使用‘lme’建模，但不包括性别作为固定效应。事后成对比较使用‘emmeans’进行，采用Tukey p值调整方法。

3 结果

3.1 存活

直接暴露于热休克（HS）降低了两代M. sexta幼虫至羽化的存活。早期与晚期HS均显著降低存活，但时机无显著差异。对于F1代，亲代处理的间接效应未显著影响子代幼虫存活。性比未显著偏离1:1预期比例。

热休克暴露平均减少成虫寿命1–2天。这种减少在P代对早期与晚期热休克均显著，但在F1代仅晚期热休克显著。雄性成虫寿命倾向于短于雌性。亲代处理未间接影响子代成虫寿命。

3.2 质量与发育时间

羽化质量仅对F1代受直接HS处理显著影响，但两代均呈现一致模式。F1代暴露于晚期热休克的蛾平均显著小于对照，但仅 marginally 小于早期热休克蛾。尽管不显著，P代晚期热休克蛾的成虫质量也呈相同趋势，且两代蛹质量均受晚期热休克的显著负面影响。成虫雄性显著小于雌性。亲代处理的间接效应未显著影响子代羽化质量。

发育时间（从孵化至羽化的天数）在两代中均因早期与晚期直接热休克处理而延长约1–2天。发育时间表现出亲代处理的跨代效应：由早期热休克亲代产生的F1个体，羽化天数在所有直接处理中均减少。

3.3 繁殖力

HS暴露对卵孵化成功有强烈影响，但对每对交配产卵数无显著影响。早期热休克对的孵化比例与对照无显著差异，但晚期热休克蛾产的卵在两代中均无一孵化。尽管直接HS处理对产卵数不显著，但晚期HS对倾向于产较少卵。亲代处理的间接效应对F1代总产卵数或孵化比例不显著。

3.4 卵大小

卵大小的大部分变异由蛾对而非处理条件解释。直接HS处理效应不显著，尽管两代中晚期热休克蛾产的卵平均倾向于略小。亲代处理未间接影响F1代卵大小。

4 讨论

4.1 Within-Generation 效应——晚期而非早期热休克显著降低生育力

早期与晚期热休克均导致成虫表现与适合度性状的负面影响，包括存活降低、羽化发育延迟与成虫寿命缩短。对于大多数测量，热应激时机（早期vs晚期）对这些效应的幅度无强烈差异。但繁殖例外：晚期热休克处理的蛾未产生任何可存活后代（零卵孵化成功），而早期热休克蛾的生育力与对照处理无显著差异。

尽管较不明显，晚期幼虫热休克对其他一些性状也有略更负面的后果。羽化质量（与蛹质量）、成虫寿命与每对交配蛾产卵数倾向于对晚期热休克处理有更大减少，但此效应比卵孵化成功更微妙。

24小时热休克对田间条件不现实；40°–42°C范围可能仅在日中发生几小时。由于对引发 carry-over 与 transgenerational 效应的条件敏感性理解仍有限，本研究选择使用极端24小时HS以确保不遗漏任何在更自然热浪条件下可能存在但较不明显的效应。

由于本研究将同一处理的雄雌繁殖在一起，无法确定哪一性别导致晚期热休克处理的不育。大量证据表明，雄性繁殖在许多昆虫物种中对热应激高度敏感，但其他研究也发现热应激对雌性生育力的影响。

对照个体在本实验中也显示显著降低的卵孵化成功。一个可能解释是幼虫饲养期间经历的25°C ± 10°C波动导致负生育力效应。虽然25°C ± 10°C饲养条件对该种群不认为是胁迫的，但成虫阶段的表现与适合度此前未评估。

早期与晚期热休克均导致羽化年龄增加（约比无热休克对照晚1–2天）。此延迟主要归因于紧接24小时热休克后下一阶段的延迟（早期处理延迟蜕皮至4龄，晚期处理延迟漫游），且发育减少未在后续阶段持续累积。M. sexta幼虫在长时间暴露于40°C以上温度时停止/减少摄食，这可能 contribute to 热休克幼虫质量增加减少。蜕皮由幼虫达到临界体重触发，因此幼虫在从热休克恢复后弥补此质量赤字所需时间可能是此延迟的主要驱动因素。

4.2 跨代效应——早期热休克亲代的子代发育更快

发育时间是唯一受亲代热休克处理间接效应显著影响的测量。早期热休克亲代的子代比无热休克亲代的子代早约1天羽化为成虫，且此效应在所有三种F1热休克处理中一致。对于每年多代的昆虫草食者（包括M. sexta），更短发育时间可通过两种机制增加适合度：减少因捕食与寄生导致的幼虫死亡率，以及缩短世代时间。

有趣的是，与E亲代处理相关的更快发育并未降低羽化质量。这表明HS亲代的幼虫即使未直接暴露于热休克，也能吃得更多且生长更快。与更快发育时间相关的任何权衡是否存在不完全清楚。存活比例对EE个体相较于NE处理组略低（尽管不显著），但总体此趋势对其他直接处理组不显著。

跨代可塑性的估计可能难以与世代内强选择效应区分，例如通过存活偏差。尽管无法完全排除此可能性，但本研究通过将F1代全同胞分割 across treatments 试图控制此问题。使用实验室种群也有帮助，因为遗传多样性应较少，因此处理内表型间变异较少。

由于未分别测试母体与父体效应，无法推测潜在机制。母体亲代影响子代性状的一种方式是通过卵供给。本研究中卵大小在早期与对照处理间无差异，但卵供给差异不一定由更大卵大小指示。对于可能的表观遗传机制， metamorphosis 伴随 substantial 转录重编程，由关键发育基因（包括保幼激素（juvenile hormone）与蜕皮激素（ecdysone））的DNA甲基化模式变化 facilitated。

尽管亲代处理的间接效应对总产卵数不显著，但EE蛾对 somewhat 是异常值，平均产卵 notably 多于NE蛾对。这可能暗示亲代处理在生物学上相关的有益效应，即当子代直接暴露于与亲代相同热条件时产更多卵。然而，EE处理组内蛾产卵数存在 substantial 变异，此趋势可能仅因交配蛾对间高水平个体变异所致。

5 结论

温度对繁殖与其他关键适合度性状的作用通常仅在成虫热环境中被主要考量。然而，如本研究所示，早期生命阶段的高温暴露可产生持续效应，显著影响世代内成虫性状以及下一代的子代性状。温度暴露的时机 clearly 重要，未来工作应阐明这些热敏感发育窗口的边界，并使用额外、更现实的热条件评估 within- 与 across-generational 温度效应的 impacts。更全面理解热 carry-over 效应如何塑造生物体一生及潜在跨后续世代的适合度，将有助于改进预测气候变化影响的框架。