环境因子驱动英吉利海峡细菌群落空间分布与季节演替：基于2018年春季与夏季的生态学研究

本文通过2018年春季与夏季航次调查，系统揭示了英吉利海峡法国沿岸水体环境因子（SPM、POM、PIM、NO2?/NO3+、盐度、Chl-a等）对细菌群落结构（如Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria等）空间分布与季节演替的影响，为海洋微生物生态及生物地球化学循环研究提供重要基线数据。

　　

引言

在海洋生态系统中，微生物在生态系统功能（如初级生产力、营养盐再生、微生物循环等）和恢复力中扮演关键角色。它们不仅通过控制食物网底层的营养循环影响生物地球化学通量、生物量生产和渔业产量，还通过CO₂固定/O₂生产、温室气体封存和气候气体排放影响大气和气候。微生物群落结构持续响应营养盐、物理和化学条件等生物和非生物参数，保持动态平衡。生长、迁移和物理浓度直接影响类群丰度，而捕食、裂解、沉积、稀释和迁移通常起到稳定种群波动的作用。因此，尽管物种之间存在资源竞争，它们仍能在具有相似性质的水团中共存。然而，微生物群落的季节和空间动态，尤其在分子和遗传水平的许多细节，尚未得到充分表征和理解。

英吉利海峡（EC）是位于大西洋温暖水域和北海寒冷水域之间的过渡性边缘海，以强潮汐流产生的高湍流为特征。潮汐流和东风负责准均匀的垂直混合，并影响从大西洋到北海的水团输送（平均传输时间6-12个月）。此外，河流输入（如塞纳河、索姆河等）影响海峡的水循环以及盐度和营养盐浓度。英吉利海峡分为三个不同区域：西部英吉利海峡、中部英吉利海峡-塞纳湾和东部英吉利海峡。大西洋水域对西部区域影响较大。英吉利海峡入口以季节性的乌尚潮汐锋为标志，西部为分层水团，东部为混合水团，作为微生物浮游群落的生态边界。西部英吉利海峡在春季和夏季出现热分层，潮汐动力学也在诺曼底-布列塔尼海湾诱导许多涡流。中部英吉利海峡受英国和法国海岸的河流径流影响，包括塞纳湾由塞纳河及周边河口输入产生的永久盐跃层分层。东部区域（法国侧的东部英吉利海峡）以海湾和河口为特征，高比例的陆源物质和半咸水直接排入海中，定义了一个淡水影响区域（ROFI），与近海水域通过称为“海岸流”的锋面系统分离。此外，英吉利海峡（特别是多佛海峡）是最繁忙的海上航运路线之一，船舶活动也可能调节生态系统的水文条件。上述所有条件导致英吉利海峡沿线的生态远洋生境范围广泛。

尽管英吉利海峡的沿海和远洋海洋水域的观测和监测计划已建立数十年，但大多数微生物分类多样性调查集中在使用显微镜和/或台式流式细胞术的浮游植物。近年来，通过采用针对rDNA基因的下一代测序（NGS），开始在分子水平探索英吉利海峡少数位置的微生物群落组成。实际上，分子方法和NGS可以提供大量有关海洋微生物群落组成的信息，并被推荐作为观测计划的一部分，以进一步探索/监测英吉利海峡的微生物多样性。在气候变化时代，沿海生境受到海洋变暖和酸化等事件的强烈影响。因此，本研究旨在通过分子方法调查法国英吉利海峡沿岸生境的生态和微生物演替，包括环境参数和遗传水平的微生物多样性。这项工作旨在为探索将浮游细菌多样性纳入沿海远洋生态系统模型的可行性以及使用浮游细菌多样性变化作为计算远洋生境和沿岸水域状态指标的潜在度量标准提供基线。

材料与方法

在2018年春季（4月18日至5月2日）和夏季（7月16日至31日）进行的两次“EcoPel”海洋学考察中，使用Niskin瓶采集了108个次表层（2米）海水样本，其中春季56个，夏季52个。海水样本立即通过150μm筛网预过滤以去除大型生物（如后生动物）和大菌落/颗粒，然后过滤至0.22μm Sterivex滤芯（MilliporeSigma）直至滤器堵塞。过滤海水体积因样本而异，范围从142mL（站点33）到6500mL（站点48）。Sterivex滤芯立即用Parafilm包裹并在-80°C保存直至DNA提取。

使用CTD探头（SBE19, Sea-Bird Scientific, USA）获取海表温度（SST, °C）和盐度（S, PSU）。使用Futura II自动分析仪（AMS Alliance, Italy）分析亚硝酸盐（NO₂^?, μmol L^?1）、硝酸盐（NO₃^?, μmol L^?1）、磷酸盐（PO₄^3?, μmol L^?1）和硅酸盐（SiOH₄, μmol L^?1）浓度。根据SOMLIT网络的既定协议，通过预燃烧GF/F过滤器（0.7μm）过滤前后的重量差测定悬浮颗粒物（SPM, mg L^?1）。使用Fisons CHN分析仪（Fison, Glasgow, UK）估算颗粒有机碳和氮（POC和PON, μg L^?1）。按照荧光协议（Aminot et al. 2004），将叶绿素-a（Chl-a, μg L^?1）和脱镁色素（μg L^?1）样品在90%丙酮中提取24小时，使用10-AU荧光计（Turner Designs, CA, USA）测量。

使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany）从Sterivex过滤器提取总核酸，并通过Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）测量DNA浓度。使用通用引物S-D-Bact-0341-b-S-17（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和S-D-Bact-0785-a-A-21（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）（Klindworth et al. 2013）扩增原核生物16S rRNA基因的高变V3-V4区域。扩增子文库构建和Illumina MiSeq双端测序（试剂盒v2，2×250 bp）由GenoScreen（Lille, France）进行。测序数据已提交至NCBI序列读长存档数据库（SRA登录号：PRJNA1242094）。

使用MOTHUR v1.44.1程序（Schloss et al. 2009）处理从Illumina测序获得的1,889,181条读长，遵循标准操作程序（Kozich et al. 2013）。根据索引标签提取和分离序列，去重复为独特序列，并与SILVA数据库v138（http://www.arb-silva.de）（Quast et al. 2013）比对。使用UCHIME程序（Edgar 2010）去除疑似嵌合体。质量过滤后，每个样本平均17,332（±3214）条读长在97%相似性阈值下聚类为操作分类单元（OTUs）（Behnke et al. 2011）。去除单例（在整个数据集中只有一条代表序列的OTUs），因为这些很可能是错误的测序产物（Behnke et al. 2011; Kunin et al. 2010）。整个数据集标准化后，所有剩余的1,058,920条读长聚类为10,896个OTUs，平均大小449bp，并使用BLASTN（Altschul et al. 1990）与SILVA数据库（Quast et al. 2013）进行搜索。仔细检查BLASTN结果并手动策划，为每个OTU分配推定的分类归属。被识别为真核生物（如叶绿体）的OTUs从分析中移除，以专注于细菌多样性。

使用“FactoMineR”包（Lê et al. 2008）在R（v 4.0.1）（R Core Team 2021）中对标准化环境参数进行主成分分析（PCA），评估站点与环境变量之间的关联。基于获得的PCA双标图，计算站点之间的欧几里得距离矩阵。然后使用“cluster”R包中的“hclust”函数，基于Ward最小方差法（Ward Jr 1963）和“Ward.D2”聚类方法对相异矩阵进行层次聚类分析。该方法通过最小化总簇内方差来定义界限清晰的组（Ward Jr 1963）。

使用Past 3.05程序（Hammer et al. 2001）基于Chao、Berger–Parker、Simpson和Shannon估计量计算Alpha多样性。基于每个样本中的单例和双例计算Chao（Chao1）丰富度指数，估计预期OTUs的理论数量（Chao 1984）。Berger–Parker指数给出给定样本中最丰富物种的比例丰度（Berger and Parker 1970）。Simpson指数（1-D）基于两个个体属于同一OTU的概率：范围从0（所有分类单元同等存在）到1（一个分类单元在群落中占主导）（Simpson 1949）。通过将Shannon多样性指数（H′）除以最大多样性（H'max）计算Shannon均衡度指数（Lloyd and Ghelardi 1964; Pielou 1966; Shannon 1948），反映群落的均匀性。

使用“R”程序（R Core Team 2021）进行Beta多样性分析和可视化。基于OTUs（或物种）丰度，使用“Vegan”包中的“vegdist”函数，在平方根转换的OTU读长丰度上计算Bray–Curtis相异矩阵（Bray and Curtis 1957），常用于计算生态距离。平方根转换旨在减少稀有和非常丰富OTUs之间的离散度。微生物组合按采样日期和位置分组。然后使用Ward方法（Ward Jr 1963）对相异矩阵进行层次聚类分析。从层次聚类分析生成的树状图中，使用“NbClust”函数（Charrad et al. 2014）计算Dunn指数（Dunn 1974），以获得最佳簇群数量。春季和夏季的样本分别分析，除非聚类整个数据集的微生物群落。为了确定每个OTU对不同簇形成的贡献（%），使用PRIMER v6.0（Clarke and Gorley 2006）进行相似性百分比（SIMPER）分析。

使用典型对应分析（CCA）（ter Braak 1986）和Mantel相关分析（Mantel 1967）研究环境参数对浮游细菌群落结构的影响。使用“Vegan”包（Oksanen et al. 2020）的“CCA”功能，检查环境因素与细菌分类单元之间的关系。使用“envfit”函数和999次置换（Han et al. 2019）计算环境参数与最丰富细菌分类单元之间的显著相关性（p值 < 0.05）。移除不显著的环境因素和细菌分类单元后，使用“Vegan”包进行方差分析（ANOVA）以测试新CCA模型的显著性。通过执行Mantel分析评估细菌分类组成与环境参数之间的相关性。首先计算环境变量的Spearman pairwise相关性，然后基于欧几里得距离，使用“Vegan”包和9999次置换进行分类组成与环境参数之间的Mantel相关性。

结果

环境变量

硝酸盐和亚硝酸盐、颗粒有机物和悬浮物的浓度在春季高于夏季，而海表温度在夏季航次中更高。对环境变量进行的主成分分析（PCA）允许在春季和夏季分别区分8和9个不同的远洋生境。PCA投影的前两个维度分别贡献了春季和夏季总变异的54.3%和61.9%。在春季，悬浮物、颗粒无机和有机物质、硝酸盐和亚硝酸盐、盐度、浊度和溶解有机碳（按贡献增加排序）每个对PCA两个维度的形成贡献>10%。在夏季，悬浮物、硅酸盐、叶绿素-a、盐度、硝酸盐和亚硝酸盐、浊度、铵、脱镁色素、颗粒和溶解有机碳（按贡献增加排序）每个对PCA两个维度的形成贡献>10%。

根据基于环境变量的层次聚类分析结果，春季水团可分为8个远洋生境或水类型，表征了三个主要簇：北海水域（组P1）、“沿海”水域（组P2、P6、P3、P8和P7）和“近海”水域（组P4和P5）。北海水域（P1）与低浓度的悬浮物、颗粒有机和无机物质以及高盐度相关。P2主要对应于北海和东部英吉利海峡中不连续分布的沿海水域，以高值的悬浮物、颗粒有机和无机物质为特征。位于东部英吉利海峡和北海东侧的沿海水域属于P3，以高浓度的悬浮物、颗粒有机和无机物质、溶解有机碳和叶绿素-a为特征。P4和P5包括分布在西部和东部英吉利海峡的近海水域，具有相对均匀的生物地球化学变量， except 高盐度和铵浓度。P6对应于可能受大陆径流影响的沿海水域，具有高营养盐浓度（硅酸盐、磷酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐和溶解有机碳）、叶绿素-a、脱镁色素、浊度和温度。P7和P8各对应一个站点，直接受塞纳河河口输入的影响，具有更极端的环境值。P7、P8、P6、P4和P5的水类型突出了塞纳河径流和浊度在沿海-近海梯度上的稀释。

夏季站点根据环境变量可分为9个远洋生境或水类型，并可进一步分类为：“近海”水域（组U6和U9）、“沿海”水域（组U1、U2和U5）和“外来”水域（组U3、U4、U7和U8），这些水域直接受河流排放和/或连续径流的影响。U1对应于东部英吉利海峡和北海的沿海水域，与任何特定环境变量没有强烈关联。然而，U1水域以高营养盐浓度、叶绿素-a和颗粒为特征。北海水域（U2）显示较高的盐度和悬浮物负荷。值得注意的是，U2中的一个站点（105）也位于C?te d'Armour（诺曼底-布列塔尼海湾）区域。U5水域受环境变量和河流输入的影响中等。U3和U4水域沿东部英吉利海峡和北海的海岸分布。这两个组与高浓度的悬浮物、叶绿素-a、颗粒有机物和浊度（特别是U3）以及高浓度的营养盐（磷酸盐、硅酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐）、颗粒和溶解碳、脱镁色素和较高温度相关。因此，这些组被命名为“外来”水域，表明直接受到大陆和河流营养盐和物质输入的强烈影响。U7和U8水域由于其位于塞纳河排放区，也被纳入“外来”类别。最后，“近海”类别（U6和U9）以高盐度和低浓度的营养盐和有机物为特征。U6对应于进入并在英吉利海峡循环的大西洋水域，而U9对应于围绕海峡群岛、诺曼底-布列塔尼海湾和C?te d'Armour的沿海-近海断面区域。

总体微生物多样性

在两个航次中共识别出10,896个OTUs，其中春季7229个，夏季6243个。春季和夏季之间共享2576个OTUs（23.6%）。平均而言，从春季和夏季收集的108个样本中每个样本检测到396（±82）个OTUs。Alpha多样性指数，包括OTU数量、Chao、Berger-Parker和Simpson，表明两个采样期之间无显著差异（Mann–Whitney p值 > 0.05）。然而，丰富度和均匀度Shannon指数在两个采样期有显著差异（Mann–Whitney p值 < 0.01），夏季的丰富度和均匀度高于春季。Shannon（H′）和Simpson（1-D）指数在同一采样期显示相似的空间模式。在春季，东部英吉利海峡的Dieppe和Calais之间区域发现低丰富度和均匀度，最低值记录在索姆湾和C?te d'Opale之间的近海站点16。相反，较高的丰富度和均匀度通常出现在西部英吉利海峡的近海水域、南北海和塞纳湾，热点在站点1、2、34和46。在夏季，丰富度和均匀度模式似乎相反，西部英吉利海峡和塞纳湾的近海水域值较低（塞纳河河口附近除外），而从Dieppe到南北海区域值较高。此外，诺曼底-布列塔尼海湾和C?te d'Armour区域的站点在夏季显示高Shannon和Simpson值（由于春季航次的天气条件，该区域未采样）。

对整个数据集进行的层次聚类分析结果描绘了英吉利海峡细菌群落结构的明显季节性，树状图中的站点分组根据采样季节。对于细菌群落结构，春季航次的样本组织成9个簇，夏季航次的样本组织成11个簇。这些簇清楚地划定了不同的水团，其中细菌多样性由生物地球化学变量、海流和河流排放塑造。在两个季节中，细菌群落的结构可以基于四个地理区域表征：东部英吉利海峡、西部英吉利海峡、塞纳湾和南北海。尽管作为一个单独的簇分组，北海簇中的站点在春季显示群落结构更接近东部英吉利海峡簇中的站点，但在夏季更接近塞纳湾中的站点。有趣的是，索姆河河口似乎将东部英吉利海峡分为两部分：南部受塞纳河影响，北部显示不同的细菌群落层，围绕从沿海到近海水域的梯度结构。

分类多样性

在两个采样期，检测到30个主要细菌分类群。最主要的两个群， together 代表所有读长的73.5%，是：Proteobacteria（主要是α-和γ-proteobacteria），代表所有读长的45.6%，和Bacteroidetes（主要是Flavobacteriales，以及少数Bacteroidales、Chitinophagales和Cytophages），代表所有读长的27.9%。其他显示超过0.1%所有读长的群包括Actinobacteria（9.4%的读长）、Cyanobacteria（11.2%）、Planctomycetes（0.9%）和Verrucomicrobia（4.7%）。

春季群落结构

在春季，主要细菌分类群（>总读长的0.5%）的分布显示清晰的空间模式。塞纳湾中绝大多数门属于Proteobacteria和Bacteroidetes。在敦刻尔克近海和北海南部观察到较高比例的Cyanobacteria和Verrucomicrobia。西部英吉利海峡的Actinobacteria比例高于东部英吉利海峡。

Proteobacteria（春季群落的41.1%）是最丰富的门。特别是，Proteobacteria在英吉利海峡的比例相对恒定，对应所有细菌读长的约50%。然而，在北海南部和布列塔尼半岛顶端（Iroise海和Finistery）发现较低比例的Proteobacteria。Bacteroidetes（春季群落的38.2%）是第二丰富的门。在北海南部，Bacteroidetes显示较低丰度，然后丰度随着向南进入东部英吉利海峡的梯度增加。尽管总体丰度较低，Chitinophagales和Cytophagales在北海南部占Bacteroidetes丰度的较高比例，并且它们的比例随着向南的梯度减少。在塞纳河河口（站点34），观察到较高比例的Chitinophagales和Bacteroidales（ together 代表总Bacteroidetes读长的约20%）。在塞纳湾地区和西部英吉利海峡，Bacteroidetes通常显示较低丰度，最低读长数出现在Cotentin半岛近海（站点43和44），读长数向西增加（站点45–49）。在该区域（站点44），观察到较高比例的Cytophagales，代表所有Bacteroidetes读长的16%。最后，在大西洋水域进入布列塔尼半岛顶端的Iroise海 near Brest（站点49–57），观察到较高丰度的Bacteroidetes（主要由Flavobacteriales组成）。

Cyanobacteria（春季群落的11.4%）在北海南部与其他位置相比，在细菌读长中代表较高比例。在Cyanobacteria门内，识别出两个纲：Oxyphotobacteria（多数）和Sericytochromatia（少数）。Actinobacteria（春季群落的5.2%）在布列塔尼半岛（站点39–48）和Cotentin半岛（站点53–56）附近与其他位置相比，占细菌读长的较高比例。在Actinobacteria门内，Microtrichales和Actionomarinales（在Acidimicrobiia纲中）是两个最丰富的目，除了在塞纳河河口的站点32（具有较高Frankiales，在Actinomycetes纲中），以及在北海南部（站点1–7）和Boulogne-sur-mer附近（站点12–13）（具有多样的分类目）。Verrucomicrobia（春季群落的3.2%）在北海南部和Brest附近水域与其他位置相比，更有代表性。在Verrucomicrobia门内，Opitutales和Verrucomicrobiales（在Verrucomicrobiae纲中）是两个最丰富的目，除了在Iroise海和Brest湾的站点，其中观察到非常高比例的Verrucomicrobiales（站点49–57）。

夏季群落结构

在夏季，大多数OTUs分布在6个不同的门：Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Planctomycetes、Proteobacteria和Verrucomicrobia。通常，Proteobacteria和Bacteroidetes（如春季）是两个最丰富的门， together 代表所有夏季读长的三分之二。然而，与春季群落相比，夏季群落中Actinobacteria、Planctomycetes、Proteobacteria和Verrucomicrobia的比例增加，而Bacteroidetes的比例减少（仅在站点93达到总读长的50%）。在英吉利海峡东部盆地观察到高比例的Planctomycetes和Verrucomicrobia，而在塞纳湾观察到较高比例的Actinomycetota。然而，最低读长记录在西部塞纳湾（Veys湾）的站点92。

Proteobacteria（夏季群落的45.6%）是最丰富的门。特别是，Proteobacteria在西部英吉利海峡的夏季群落中占比较高，与春季群落相比。在Proteobacteria门内，在东部英吉利海峡和塞纳湾（除了Veys湾的站点92）观察到较高比例的Gamma-proteobacteria和Delta-proteobacteria。Bacteroidetes（夏季群落的16.6%）是第二丰富的门，尽管其在群落中的比例与春季相比显著下降。总体而言，超过90%的Bacteroidetes属于Flavobacteriales目，除了站点68、82和107。除了Flavobacteriales，Sphingobacteriales主要在东部英吉利海峡发现，而Chitinophagales主要在塞纳湾观察到（所有上述目属于Bacteroidia纲）。值得注意的是，在C?te des Abers近海的站点107，观察到具有最低比例Flavobacteriales和最高比例Balneolales（在Rhodothermia纲中）的群落组成。

Actinobacteria（夏季群落的14%）在夏季群落的北海、东部英吉利海峡和塞纳湾与春季群落相比，占据较高比例。对于大多数站点，超过90%的Actinobacteria属于Actinomarinales目（在Acidimicrobiia纲中），除了站点108，其中群落由70% Actinomarinales、20% Nitriliruptorales（在Nitriliruptoria纲中）和10% Microtrichales（在Acidimicrobiia纲中）组成。Cyanobacteria（夏季群落的11%）在西部英吉利海峡的夏季群落中显示较高比例，在北海中比例较低，与春季分布相反。在夏季所有样本中，仅在Cyanobacteria内识别出Oxyphotobacteria纲。Verrucomicrobia（夏季群落的6.3%）在东部英吉利海峡的夏季群落中（与春季相比，以及与西部英吉利海峡相比）更有代表性。通常，在Verrucomicrobia门内，Opitutales和Verrucomicrobiales是两个最丰富的目，站点82和92具有最高比例的Verrucomicrobiales（>95%）。此外，在塞纳湾（除了站点92）和C?te des Abers的站点109，观察到高比例的Pedosphaerales（所有上述目属于Verrucomicrobiae纲）。Planctomycetes（夏季群落的1.4%）在东部英吉利海峡和塞纳湾的夏季群落中（与春季相比，以及与西部英吉利海峡相比）更有代表性。大多数Planctomycetes属于Planctomycetacia纲、Phycisphaerae纲和Planctomycetes OM190分支。值得注意的是，对于在Veys湾河口的站点107，Planctomycetes群落完全由Planctomycetes OM190分支组成。

Beta多样性

基于应用于整个数据集的层次聚类分析，结果将所有样本聚类为两个不同的组。有趣的是，一个组仅包含春季样本，另一个组仅包含夏季样本。这一结果表明季节性因素对细菌组合和群落结构的显著影响。如树状图所示，9个主要簇（簇A–I）在春季组下分类，而11个簇（簇1–11）在夏季组下分类。与某些生物地球化学簇中分散分布的站点（例如，组P2和U4）相反，相同或更接近群落簇（基于Bray–Curtis相异 metric）中的站点似乎都在附近。例如，春季组中的簇H和I都来自塞纳湾区域，夏季组中的簇1和2都来自东部英吉利海峡。这一结果暗示了地理/环境因素对细菌组合和群落结构的影响，尽管它们与水类型或远洋生境的对应并不总是容易建立。

为了确定每个OTU对簇形成的贡献，使用聚类结果进行了SIMPER分析。在春季，簇A、D（沿海北海和近海东部英吉利海峡）和H（塞纳湾沿海）主要受OTU1（Sulfitobacter）影响（分别为9.92%、8.32%和7.38%）。簇B（近海北海）受OTU17（Persicirhabdus, 4.7%）影响。簇C（C?te d'Opale的沿海水域）受OTU5（Polaribacter, 9.49%）和OTU27（Sulfitobacter, 7.84%）影响。在Brest湾，簇E受OTU7（Cryomorphaceae, 4.94%）、OTU9（Flavobacteriaceae_NS5, 4.78%）、OTU6（Planktomarina, 4.57%）和OTU5（Polaribacter, 4.05%）影响。簇F（西部英吉利海峡中部近海水域）主要受OTU1（