疱疹病毒去泛素化酶差异调控翻译应激反应：核糖体质量控制新机制

本综述深入探讨了人类致病性疱疹病毒编码的病毒去泛素化酶（vDUB）如何差异调控核糖体质量控制（RQC）机制。文章揭示了EBV、HCMV、KSHV的vDUB能同时抑制40S核糖体蛋白（RPS10、RPS20、RPS3）泛素化和60S核糖体蛋白（RPL26）UFMylation，从而有效干预胞质和内质网（ER）相关核糖体的翻译应激反应；而HSV1 vDUB虽能抑制泛素化，却无法拮抗RPL26 UFMylation和ER-自噬（ER-phagy），凸显了不同疱疹病毒调控翻译应激策略的重要差异。

　　

疱疹病毒去泛素化酶差异调控翻译应激反应

引言

细胞通过协调调控蛋白质合成与降解，在生理和应激条件下监测并维持蛋白质组稳态。病毒感染期间，蛋白质稳态面临严峻挑战：病毒需要重编程翻译机器以快速产生大量病毒蛋白，而细胞则试图通过激活蛋白激酶RNA激活（PKR）来抑制感染——PKR在检测到病毒核酸后磷酸化翻译起始因子eIF2α并抑制翻译。病毒通过选择性宿主关闭诱导宿主蛋白合成显著下降并同时抑制PKR的能力，凸显了维持高水平活性核糖体以支持病毒mRNA翻译的需求。尽管已经描述了病毒劫持翻译起始、延伸和终止的多种策略，但关于可能对抗翻译应激反应潜在抗病毒作用的分子事件和病毒效应物，我们知之甚少。

病毒mRNA的翻译可能具有挑战性，因为存在长重复序列、复杂的二级结构、非最优密码子使用、以及频繁发生的移码和核苷酸错误掺入，这些都可能减慢翻译速度或诱导核糖体停滞。虽然延长周期暂停可能解决小问题，但持续的停滞和核糖体碰撞会触发核糖体应激反应（RSR），通过ZAKα依赖性激活JNK和p38激酶，引发炎症并可能最终导致细胞死亡。细胞已经发展出救援策略，通过激活核糖体相关质量控制（RQC），拆分停滞的核糖体，促进受损mRNA和异常翻译产物的处置，并允许核糖体亚基的回收。

RQC由碰撞的二体和三体或停滞核糖体的识别启动，连接酶对40S颗粒进行位点特异性单泛素化。在延伸阻滞诱导的RQC（eRQC）中，RING结构域连接酶ZNF598泛素化RPS10（eS10）和RPS20（uS10），这引发核糖体亚基被ASC-1复合物拆分，NEMF识别60S-肽基-tRNA缀合物进行CAT尾部添加，Listerin对新生肽进行泛素化，VCP/p97伴侣蛋白从缀合物中提取肽段，随后被蛋白酶体降解。当核糖体在起始密码子处停滞时，RNF10连接酶泛素化40S蛋白RPS3和RPS2，通过蛋白酶体依赖性降解靶向40S颗粒，这一过程称为起始RQC（iRQC），并被USP10去泛素化酶抑制。RPS2和RPS3在通过GCN2激酶磷酸化eIF2α触发整合应激反应（ISR）时也会被泛素化。

共翻译插入内质网（ER）的核糖体停滞会激活eRQC的一个分支，称为ER-RQC，它依赖于60S亚基被类泛素修饰剂-1（UFM1）进行翻译后修饰。尽管ER-RQC的组分、识别信号和详细组织仍知之甚少，但UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3连接酶复合物对RPL26（uL24）的UFM化被证明是启动信号级联所必需的，该级联导致新生多肽被提取到胞质中进行蛋白酶体降解，或通过溶酶体降解肽段本身或连同一小部分ER，这一过程称为ER-自噬（ER-phagy）。

病毒mRNA的挑战性结构以及相对较小的病毒蛋白质组大规模生产引起的tRNA耗竭表明，病毒感染的细胞可能特别依赖于RQC的微调，以确保有足够的功能性核糖体水平来支持病毒生产。先前研究表明，爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）大被膜蛋白BPLF1的N端结构域编码的病毒去泛素化酶（vDUB）通过调节停滞核糖体的泛素化和UFM化，抑制了RQC和ER-RQC，从而促进了病毒蛋白的翻译并增强了感染性病毒颗粒的释放。

结果

疱疹病毒vDUB抑制40S核糖体泛素化，拯救模型eRQC底物并促进停滞诱导mRNA的通读

不同的翻译应激类型触发以40S核糖体蛋白位点特异性泛素化为特征的RQC反应。为了评估vDUB是否对抗这些泛素化事件，在ZNF598-KO细胞系中重建了ZNF598的表达，并与FLAG标记的EBV-BPLF1、HCMV-UL48、KSHV-Orf64和HSV1-UL36的催化结构域或空载体共转染。正如预期，在共转染空载体的细胞中，ZNF598的过表达导致RPS10的显著泛素化和RPS20的多聚泛素化。在共表达每种vDUB的细胞中，泛素化被强烈抑制，支持了病毒酶共享对抗ZNF598连接酶活性的能力的结论。与重建的ZNF598-KO细胞中观察到的效果一致，在用50 ng·mL^?1茴香霉素（ANS）处理30分钟以促进随机核糖体碰撞和RQC激活的条件下，vDUB抑制了HEK293T细胞中内源性RPS10的泛素化。

核糖体在起始密码子处的停滞触发iRQC，其中RNF10连接酶泛素化40S蛋白RPS3和RPS2。为了评估vDUB是否可能干扰RQC的这一分支，在转染了FLAG空载体/BPLF1/UL36/UL48/Orf64的HEK293T细胞中，通过ANS处理诱导翻译停滞后，研究了RPS3的泛素化。在表达每种vDUB的细胞中再次观察到RPS3泛素化的显著抑制。值得注意的是，尽管HSV1-UL36抑制核糖体泛素化的效率略低于同源物，但这种差异与通过Ub-VS功能探针标记评估的酶活性强度无关。

RQC的抑制阻止了蛋白酶体对异常翻译产物的降解，并且在长时间的核糖体停滞后，可能允许翻译重新启动，导致停滞诱导区域的通读。为了测试vDUB功能性干扰这些RQC结果的能力，使用了一套报告质粒，其编码框内绿色荧光蛋白（GFP）和樱桃荧光蛋白（ChFP），中间由包含20个AAA编码的赖氨酸残基（K20）的连接子分隔。在K20报告中，翻译核糖体通过poly(A)伸展区导致核糖体停滞和碰撞，从而激活eRQC并促进蛋白酶体对停滞多肽的降解。与之前发现BPLF1及其同源物抑制缺乏终止密码子的GFP报告基因的蛋白酶体降解一致，将K20报告基因与FLAG标记的BPLF1、UL36、UL48或Orf64共转染，导致大小略大于全长GFP的多肽（在图中用红色箭头指示）显著稳定，该多肽来源于poly(A)序列处的翻译停滞。因此，证实了vDUB共享拯救真正RQC底物的能力。

为了进一步研究被抑制的RQC反应是否也可能导致mRNA通读增强，使用了一种双荧光报告基因，该报告基因表达GFP和RFP，中间由单独含有绒毛蛋白头片段（VHP）的连接子（GFP-VK0-RFP）或融合了K20停滞诱导结构域（GFP-VK20-RFP）连接。VHP区域两侧存在核糖体2A跳过序列（P2A），允许独立评估连接子前后的翻译。将GFP-VK0-RFP和GFP-VK20-RFP报告基因与FLAG空载体/BPLF1/UL36/UL48/Orf64共转染到HEK293T细胞中，并通过FACS测量GFP和RFP荧光强度。在表达GFP-VK0-RFP报告基因的细胞中划定了一个通读区域，基于线性相关的GFP和RFP荧光，对应的平均RFP/GFP比率接近1。将GFP-VK20-RFP报告基因与对照空载体共转染时，K20下游翻译的强烈抑制导致约80%的细胞积累在一个停滞区域，其中RFP/GFP荧光比率远低于1。vDUB的表达拯救了显著的RFP荧光水平。结果高度可重复，50-80%的vDUB转染细胞出现在通读象限。值得注意的是，尽管RFP拯救频率很高，但与GFP-VK0-RFP/vDUB转染细胞相比，GFP-VK20-RFP/vDUB转染细胞中的RFP荧光强度仍然较低，这可能是由于在不同阅读框中重新启动翻译导致荧光RFP物种表达减少。

HSV1-UL36不抑制ER-RQC

在确定vDUB共享抑制eRQC和iRQC分支的能力后，接下来探究ER-RQC是否同样受到影响。为了区分胞质和ER相关事件，对K20报告基因进行了修饰，在其N端插入了一个ER定位信号和糖基化位点（ER-K20），这选择性地促进了翻译ER靶向蛋白的核糖体停滞。将HEK293T细胞与FLAG空载体/BPLF1/UL36/UL48/Orf64质粒和ER-K20报告基因共转染，并用GFP抗体进行免疫印迹检测翻译产物的丰度。作为溶酶体和蛋白酶体依赖性降解的对照，用Bafilomycin A1（BafA1）或Carfilzomib过夜处理共转染空载体的细胞。在转染空载体的HEK293T细胞中检测到两条约50和48 kDa的微弱GFP条带。较低的条带大小对应于在poly(A)序列处停滞的含有信号肽的前体肽。这一点，加上对Endo-H处理的抗性，表明该肽要么被释放到胞质中，要么积累在ER的胞质面。根据Endo-H处理引起的迁移位移，上方的条带对应于缺乏信号肽的ER定位的糖基化肽。与管腔ER-RQC底物靶向溶酶体依赖性降解的观点一致，50 kDa的物种在用BafA1处理的细胞中积累，而Carfilzomib和BafA1都促进了非糖基化前体肽的积累。BafA1对非糖基化前体肽的稳定作用表明，仍然与ER膜相关（可能被困在易位子中）的那部分肽段受到溶酶体依赖性降解。FLAG-BPLF1、FLAG-UL48和FLAG-Orf64的表达拯救了前体肽和糖基化肽，证实了vDUB抑制RQC和ER-RQC的能力。相比之下，FLAG-UL36对ER相关和胞质版本的报告基因只有边际效应，表明HSV1编码的酶不调节ER的核糖体应激反应。

HSV1-UL36未能抑制核糖体UFM化和ER-自噬

60S蛋白RPL26的UFM化是停滞在ER的核糖体的一个显著特征，并被证明是激活ER-RQC所必需的。为了研究vDUB是否调节RPL26 UFM化，首先将HEK293T细胞与S标签标记的RPL26和FLAG空载体/BPLF1/UL36/UL48/Orf64共转染，然后用50 ng·mL^?1 ANS处理1小时激活RQC。随后在含有20 mM NEM和10 mM碘乙酰胺的变性缓冲液中裂解细胞以抑制Ub/UbL去结合酶的活性，并分析S标签免疫沉淀物。在ANS处理的空载体转染细胞的S标签免疫沉淀物中，用UFM1特异性抗体容易地检测到三个条带，大小对应于与一个、两个和三个UFM1分子结合的RPL26。在表达FLAG-BPLF1、FLAG-UL48或FLAG-Orf64的细胞裂解物中，UFM化条带几乎不存在，同时未修饰的RPL26-S条带强度相应增加。相比之下，FLAG-UL36只有边际效应，表明这种vDUB可能缺乏干扰核糖体UFM化的能力。当在ANS处理的vDUB转染细胞中检测内源性RPL26的UFM化时，获得了类似的结果。同样在这种情况下，存在相当比例的非转染细胞可能解释了vDUB的效果不如MYC-RPL26共转染和免疫沉淀设置那么显著。

核糖体和ER膜蛋白的UFM化被证明可调节ER-自噬，后者参与ER-RQC底物的清除。为了测试vDUB对核糖体UFM化的影响是否影响ER-自噬，使用了一个先前描述的HCT116亚系，该亚系组成性表达一个Dox调控的ER-自噬双荧光报告基因，该报告基因由ER易位子RAMP4亚基、增强型GFP（eGFP）和mCherry荧光蛋白（ChFP）的编码序列框内融合构建而成。Dox处理后，RAMP4结构域插入ER膜，GFP和ChFP面向胞质并发出相等的荧光，而由于在低pH下GFP荧光选择性淬灭，负载ER的自噬溶酶体呈现为明显的红色荧光点，在用Baf A1处理抑制自噬溶酶体酸化后变为黄色。为了评估vDUB对此过程的影响，将报告细胞系转染表达FLAG-BPLF1/UL36/UL48/Orf64的质粒，并在存在Dox的情况下培养24小时，然后在EBSS培养基中饥饿过夜，随后通过共聚焦显微镜观察自噬体的形成。对同一载玻片上转染和未转染细胞中红色货物负载的吞噬溶酶体的分析显示，在未转染细胞和转染FLAG-UL36的细胞中存在红色点状信号，而在表达FLAG-BPLF1、FLAG-UL48或FLAG-Orf64的细胞中仅观察到弥漫的黄色荧光。对同一转染实验中阳性和阴性细胞中红色点数量的量化显示，在表达FLAG-BPLF1/UL48/Orf64的细胞中，ER-自噬被高度显著地抑制。相比之下，在大多数表达FLAG-UL36的细胞中仍检测到红色点状信号。

HSV1-UL36不促进ZAKα的激活

RQC的抑制导致MAPKKK ZAKα的激活，ZAKα在与碰撞核糖体相互作用后发生自身磷酸化，并通过磷酸化应激激酶JNK和p38来 orchestrate RSR的触发，以及通过磷酸化GCN2来触发ISR。先前研究表明，ZAKα在表达EBV-BPLF1的细胞中被激活，这与JNK和p38的磷酸化以及GCN2介导的ISR激活相关，后者可以通过ATF4的上调方便地监测到。为了测试同源物是否共享激活此通路的能力，在转染了FLAG空载体/BPLF1/UL36/UL48/Orf64的HEK293T细胞中监测了磷酸化ZAKα、JNK和p38的表达以及ATF4的上调。与EBV-BPLF1类似，HCMV-UL48和KSHV-Orf64的表达诱导了ZAKα迁移的磷酸酶可逆性位移，其幅度与ANS处理诱导的相当。相比之下，转染HSV1-UL36没有明显效果。未能促进ZAKα激活与表达HSV1-UL36的细胞中JNK和p38磷酸化较弱以及ATF4上调大幅减少相关。有趣的是，在Crispr/Cas9敲除ZAKα后，观察到相同的vDUB诱导的JNK和p38磷酸化以及ATF4激活模式，这表明在表达vDUB的细胞中，碰撞核糖体的检测和核糖体及整合应激反应的激活涉及其他机制。

讨论

核糖体蛋白通过共价连接泛素和类泛素多肽进行位点特异性翻译后修饰，在调控RQC、RSR和ISR中起着关键作用，这些反应在翻译起始、延伸或终止受阻时被激活。跨物种应激诱导修饰的保守性表明它们在翻译周期不同步骤调控中的独特作用。确实，虽然RPS10和RPS20的协调泛素化以及RPL26的UFM化被证明对于激活由翻译延伸障碍触发的eRQC和ER-RQC至关重要，但RPS3和RPS2在翻译起始时核糖体停滞后被泛素化，导致iRQC的激活，或由触发ISR的事件引发。

研究发现，人类致病性疱疹病毒EBV、HCMV和KSHV的大被膜蛋白N端结构域编码的去结合酶共享通过损害RPS10、RPS20和RPS3的泛素化以及RPL26的UFM化来阻碍RQC各个分支的能力，而HSV1编码的vDUB选择性地未能阻止RPL26 UFM化和ER-自噬的激活。协调抑制不同类型的RQC反应可能为病毒提供若干优势。一个可能的结果是促进含有各种翻译障碍的病毒mRNA的高效翻译，正如vDUB促进停滞诱导mRNA通读的能力所说明的那样。可以想见，通过联合抑制通过招募ASC-1到泛素化的RPS10/RPS20进行的解聚，以及抑制由RPS2/RPS3泛素化介导的40S降解，来稳定暂停/停滞的核糖体，可能对于在长时间暂停后实现翻译重新启动至关重要。与此可能性一致，先前研究表明内源性表达催化活性EBV-BPLF1是有效翻译病毒基因组维持蛋白EBNA1所必需的，其mRNA含有长的G-C富集区，形成抑制翻译延伸的G-四链体。值得注意的是，在KSHV编码的基因组维持蛋白LANA1中也发现了类似的长重复序列，较短的G-四链体形成重复序列存在于几种疱疹病毒（包括HCMV和HSV1）的蛋白质编码mRNA中，指出了vDUB在促进病毒蛋白翻译方面的保守功能。

研究发现，除了抑制eRQC和iRQC，EBV、HCMV和KSHV编码的vDUB共享阻碍ER-RQC的能力，表现为抑制RPL26 UFM化、将模型ER-RQC底物从蛋白酶体和溶酶体依赖性降解中拯救出来、以及抑制ER-自噬。抑制RQC的这一分支可能通过增强对感染性病毒颗粒组装至关重要的病毒糖蛋白的翻译，为病毒提供额外优势。尽管其在ER-RQC和ER-自噬中的作用已牢固确立，但RPL26 UFM化如何调控这些事件尚未完全明了。有人提出，UFM化可能是松弛核糖体-易位子连接所必需的，从而将被困多肽暴露于胞质RQC的降解之下。这一设想与发现RPL26 UFM化在促进翻译终止后核糖体从ER释放中发挥生理作用相一致。然而，触发RPL26 UFM化的事件仍不清楚，因为先前研究表明它不受ZNF598缺失的影响，而ZNF598是核糖体停滞和碰撞的主要读取器。基于观察到RPL26 UFM化可被泛素激活酶抑制剂TAK243处理所废除，并且在表达EBV-BPLF1的细胞中核糖体和相关蛋白的泛素化严重受损，先前提出EBV-BPLF1可能通过逆转构成性或核糖体停滞诱导的、能够实现UFM化的泛素化事件来发挥作用。在此背景下，HSV1 UL36未能调节RPL26的UFM化、稳定ER-RQC底物和抑制ER-自噬激活是令人惊讶的，考虑到病毒酶的可比去泛素化酶活性。可以想象，这种差异可能由HSV1编码酶的结合谱差异所解释，正如发现所述，与同源物不同，UL36未能通过与14-3-3蛋白和TRIM25相互作用来调节IFN反应，并且不通过去泛素化SQSTM/p62来抑制巨自噬。这种可能性得到了vDUB保守催化结构域内螺旋2的长度和电荷分布显著差异的证实。确实，EBV-BPLF1的螺旋2被证明可介导与cullins、14-3-3以及其他可能相互作用伴侣的结合。

先前报道，EBV、HCMV和KSHV编码的vDUB激活ISR，而HSV1编码的vDUB未能做到这一点。连同由RPS3泛素化抑制所暗示的核糖体亚基稳定化，ISR的激活可能在将翻译重编程为倾向于具有替代起始位点（如5'非翻译开放阅读框（uORF）和内部核糖体进入位点（IRES））的mRNA方面发挥重要作用，这些位点常见于病毒mRNA以及具有促生长和抗凋亡功能的细胞基因mRNA中。支持这一设想的是，BPLF1对从裂解性启动子表达的EBNA1 mRNA翻译的影响（该mRNA同时含有uORF和IRES特征）被GCN2的抑制选择性阻断。有趣的是，研究结果表明，尽管HSV1-UL36抑制RPS3的泛素化，从而模拟了细胞DUB USP10的40S亚基稳定活性，但其未能激活ISR与未能促进ZAKα激活相关。这有几个有趣的启示。首先，它表明RPS3泛素化是独立于ISR触发的，可能是43S预起始复合物在mRNA扫描过程中停滞或扫描复合物与停滞的80S核糖体碰撞的结果。此外，在表达UL36的细胞中观察到的RQC抑制与ZAKα磷酸化解偶联，以及vDUB介导的ZAKα-KO细胞中ISR的触发，表明连接ZAKα或其他读取器检测碰撞核糖体与GCN2依赖性ISR激活之间存在额外的调控步骤。

在产毒性感染期间，病毒严格依赖于细胞mRNA翻译机器来合成病毒复制和组装新病毒颗粒所需的蛋白质。病毒将细胞翻译装置转向相对较小的病毒蛋白质组大规模生产的策略已被深入研究。然而，关于病毒如何应对确保核糖体翻译保真度和处置异常翻译产物的质量控制系统的潜在抗病毒作用，我们知之甚少。研究结果首次深入探讨了人类致病性疱疹病毒感染背景下的这一问题，指出了病毒编码的vDUB在调控控制不同类型RQC反应的泛素化事件中的重要作用。HSV1-vDUB未能对抗ER-RQC和激活ISR，与发现该病毒已发展出独特的策略来对抗ISR相一致，这些策略包括由独特短区蛋白11（Us11）介导的PKR抑制、糖蛋白B（gB）物理结合导致的PERK抑制、gH相互作用导致的GCN1介导的GCN2激活抑制、以及ICP34.5与PP1c磷酸酶结合导致的所有eIF2α激酶的抑制。可以推测，疱疹病毒家族中这一成员的不同行为可能反映了对不同宿主细胞范围的适应，以及由显著更短的复制周期所要求的细胞存活通路激活的不同需求。