OTUB1通过调控SLC7A11泛素化调节胰腺β细胞铁死亡的新机制

本研究揭示了OTUB1-SLC7A11轴在胰腺β细胞铁死亡中的关键调控作用。2-脱氧-d-核糖（dRib）通过抑制去泛素化酶OTUB1表达，促进胱氨酸转运体SLC7A11泛素化降解，导致谷胱甘肽（GSH）耗竭、脂质过氧化和线粒体损伤。该发现为糖尿病β细胞保护提供了新靶点。

　　

引言

细胞死亡可分为意外性细胞死亡（坏死）和调节性细胞死亡，包括凋亡和调节性坏死。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性坏死形式，其特点是活性氧（ROS）通过芬顿反应引发脂质过氧化。该过程涉及多不饱和脂肪酸（PUFAs）产生的磷脂自由基引发的链式反应，导致膜损伤。铁死亡在生化上不同于其他细胞死亡类型，已成为多种疾病的关键机制，包括癌症、神经退行性疾病和肾脏疾病。

铁超载是糖尿病的已知风险因素，与遗传性血色素沉着症和输血相关糖尿病有关。临床证据表明，铁减少疗法（如静脉切开放血术）可改善血糖控制。胰腺β细胞由于高铁含量和低抗氧化能力，特别容易受到氧化损伤，这使得它们对铁死亡敏感。此外，葡萄糖毒性（被认为是2型糖尿病β细胞衰竭的机制）会增加β细胞中的铁含量并降低其胰岛素分泌能力。

在之前的工作中，我们发现2-脱氧-d-核糖（dRib）（一种用于模拟葡萄糖毒性的还原糖）通过破坏系统χc^?的细胞内胱氨酸转运，在胰腺β细胞中引起氧化损伤。我们还报道，在肾小管上皮细胞（RTECs）中，dRib通过增加SLC7A11（系统χc^?的轻链亚基）的泛素化和降解来诱导铁死亡。因此，在本研究中，我们旨在确定dRib是否也在胰腺β细胞中诱导铁死亡，并阐明其潜在机制。与之前关注经典铁死亡触发因素的研究不同，我们研究了一种新机制，即dRib通过降低OTUB1表达来促进铁死亡，从而导致SLC7A11泛素化和降解增加。OTUB1此前尚未在β细胞铁死亡的背景下进行研究。据我们所知，这是第一项证明OTUB1-SLC7A11轴是胰腺β细胞铁死亡关键调控通路的研究。此外，我们探讨了过表达OTUB1或SLC7A11是否可以减轻dRib诱导的脂质过氧化和β细胞死亡。这些发现表明了一个新的分子靶点，可用于保护β细胞免受铁死亡并推进糖尿病治疗。

材料与方法

材料

dRib、各种盐类、培养基、抗生素、胎牛血清（FBS）、放射性^l- [¹⁴C]胱氨酸、闪烁液、蛋白质印迹相关试剂、细胞培养皿和管等均从指定公司购买。

细胞培养和胰岛分离

RIN5mF细胞是大鼠胰岛素瘤细胞的亚克隆，保留了胰腺β细胞的关键特征，是研究β细胞死亡的合适模型。细胞在补充有10% FBS和抗生素的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂和95% O₂条件下培养。培养基每2天更换一次，细胞在达到约70%汇合度时使用胰蛋白酶进行传代。

从OrientBio Corp.（韩国）获得Sprague Dawley大鼠（6-8周龄）。按照先前描述的方法进行胰岛分离和培养。所有动物实验方案均经济州国立大学机构动物护理和使用委员会批准（协议号2022-0014）。大鼠通过二氧化碳（CO₂）吸入实施安乐死，以尽量减少痛苦。

细胞内胱氨酸转运测量

使用略微修改的Tomi等人描述的方法，测量RIN5mF细胞和胰岛中^l-[¹⁴C]胱氨酸的细胞内转运。详细方法先前已有描述。

细胞内GSH水平测量

使用基于谷胱甘肽还原酶酶循环原理的GSH测定试剂盒（Cayman）测量RIN5mF细胞和胰岛的总细胞内GSH含量。

细胞内铁水平测量

使用比色铁测定试剂盒（Sigma-Aldrich）测量RIN5mF细胞的细胞内总铁水平。

细胞活力评估

使用乳酸脱氢酶（LDH）测定评估细胞毒性。将细胞或分离的胰岛接种在96孔板中，并用指定刺激物处理24小时。使用Cytotoxicity Detection KitPLUS（Roche）测量LDH释放。细胞毒性计算并表示为存活细胞的百分比（对照的%）。

稳定细胞系

从OriGene获得编码大鼠SLC7A11、OTUB1或空载体的慢病毒颗粒。用感染复数（MOI）为10的慢病毒颗粒感染RIN5mF细胞，并在存在聚凝胺（polybrene）的情况下培养。经过1周的嘌呤霉素选择后，建立表达SLC7A11或OTUB1的稳定细胞系。

细胞内MDA和4-HNE水平测量

将MDA和4-HNE作为脂质过氧化的标志物进行量化。使用EZ-Lipid Peroxidation Assay Kit（DoGenBio，韩国）测量MDA水平，使用Universal 4-Hydroxynonenal ELISA Kit（Novus）测量4-HNE水平。结果分别表示为nmol/mg蛋白和ng/mg蛋白。

脂质ROS水平评估

使用流式细胞术和染料C11-BODIPY（Molecular Probes）测量细胞内脂质ROS水平。将细胞用指定刺激物处理6小时，在最后30分钟用C11-BODIPY处理，然后使用FACScan仪器（BD Biosciences）测量。数据表示为相对于对照荧光值的平均荧光强度的倍数比。

细胞内ATP水平测量

使用Invitrogen ATP Determination Kit（Thermo Fisher Scientific）测定细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平。基于发光测量ATP水平并归一化至总蛋白浓度。

透射电子显微镜（TEM）

为了评估与铁死亡相关的超微结构变化，将细胞用dRib处理6小时。细胞用多聚甲醛和戊二醛固定，然后用锇酸后固定。经过乙醇系列脱水后，将细胞包埋在Epon-812树脂中。制备超薄切片（约70 nm），用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜下观察。

RNA分离和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用TRIzol（Gibco Invitrogen）提取总RNA，并使用MMLV逆转录酶（MGmed Corporation）进行逆转录。使用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）和iQTM 5 Multicolor Real-Time PCR Detection system（Bio-Rad）进行RT-qPCR。基因表达水平归一化至β-肌动蛋白（β-actin）水平作为对照。所有引物序列见表1。

蛋白质印迹（Western Blotting）

细胞裂解后，等量蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用BSA封闭。膜与特定蛋白质的一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。使用Western Lightning Plus-ECL（PerkinElmer）显色。

泛素化测定和免疫共沉淀（Co-IP）

使用Protein A/G Magnetic Beads（Thermo Fisher Scientific）进行免疫沉淀。将刺激后的RIN5mF细胞裂解物与磁珠-抗体混合物孵育过夜。洗脱免疫沉淀物，并使用适当的抗体通过蛋白质印迹进行分析。将HEK293T细胞与HA-Ub、SLC7A11和/或OTUB1共转染，然后用dRib处理。使用抗SLC7A11抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀物。类似地进行免疫共沉淀，然后对特定的蛋白质相互作用进行免疫印迹。

统计分析

数据表示为平均值±标准差。使用单因素方差分析和Duncan事后检验进行组间比较，p值<0.05被认为具有统计学意义。使用SPSS软件（版本14.0；SPSS Inc.）进行分析。

结果

2-ME、铁螯合剂和脂质自由基清除剂阻止dRib诱导的脂质过氧化和细胞死亡

在RINm5F细胞中，2-ME（可绕过系统χc^?以增强胱氨酸摄取）恢复了dRib降低的细胞内胱氨酸摄取，降低了升高的细胞内铁水平，并减少了dRib引起的细胞死亡。该结果与我们之前在RTECs中的发现一致。此外，2-ME将dRib降低的细胞内GSH含量恢复至对照水平。正如预期，铁螯合剂DFO和亲脂性抗氧化剂Fer-1和Lip-1没有恢复胱氨酸摄取，但显著恢复了细胞内GSH和铁水平以及细胞死亡。dRib显著增加了细胞内MDA和4-HNE水平，这些水平被2-ME、DFO、Fer-1和Lip-1降低。流式细胞术也证实，dRib增加了脂质ROS水平，而这一点被2-ME、DFO、Fer-1和Lip-1阻止。

在分离的胰岛中，dRib降低了胱氨酸摄取，耗竭了GSH，并诱导了细胞死亡。2-ME阻止了dRib引起的胱氨酸摄取减少、GSH耗竭和细胞死亡。DFO、Fer-1和Lip-1不影响胱氨酸摄取，但确实阻止了dRib诱导的GSH耗竭和细胞死亡。DFO的保护作用被FeSO₄的加入所抵消。

dRib诱导线粒体形态变化和独特的细胞死亡

铁死在形态上不同于其他形式的细胞死亡。dRib刺激6小时后，对RINm5F细胞的TEM观察显示，核完整性和质膜保存良好，没有染色质凝聚或质膜起泡。然而，观察到了特征性的线粒体变化，包括电子密度增加、收缩和圆形，以及嵴减少和外膜破裂。铁死亡是一个需要能量的调节性细胞死亡过程。与H₂O₂诱导的坏死（其中细胞内ATP水平从过程开始就下降）不同，dRib处理的RINm5F细胞在前4小时保持其ATP水平，然后在6小时下降，这与细胞活力开始下降的时间一致。此外，已知可抑制铁死亡的抑制剂——曲格列酮（troglitazone）、米托醌（mitoquinone）和氯吉兰（clorgyline）——显著阻止了dRib诱导的脂质过氧化和细胞死亡，但不影响H₂O₂诱导的细胞死亡。

dRib改变铁死亡相关分子的表达，SLC7A11过表达抑制dRib诱导的脂质过氧化

dRib剂量依赖性地增加已知铁死亡标志物酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、ChaC谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶1（CHAC1）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）在mRNA和蛋白质水平的表达。此外，另一个关键的铁死亡调节因子GPX4的蛋白质表达以剂量依赖性方式减少。值得注意的是，虽然SLC7A11 mRNA水平以剂量依赖性方式增加，但其蛋白质水平以剂量依赖性方式降低。在分离的胰岛中也观察到类似的趋势，dRib增加了SLC7A11、ACSL4、CHAC1和PTGS2 mRNA的表达水平。为了确认dRib诱导的铁死亡是由于SLC7A11表达水平降低所致，我们使用慢病毒载体在RINm5F细胞中过表达了SLC7A11。SLC7A11过表达显著抑制了dRib诱导的细胞内MDA、4-HNE和脂质ROS水平的增加。这些结果表明，dRib通过减少系统χc^?的胱氨酸摄取来诱导脂质过氧化和细胞死亡。

dRib通过泛素-蛋白酶体系统诱导SLC7A11蛋白降解并降低OTUB1表达水平

尽管dRib增加了SLC7A11 mRNA水平，但它降低了SLC7A11蛋白质表达水平。即使在存在蛋白质生物合成抑制剂放线菌酮（cycloheximide）的情况下，SLC7A11蛋白质水平的减少也被加速，这表明dRib诱导了SLC7A11的翻译后降解。进一步的研究表明，蛋白酶体抑制剂MG132恢复了dRib降低的SLC7A11蛋白质水平，而溶酶体抑制剂NH₄Cl则没有，这表明是蛋白酶体降解。免疫沉淀和免疫印迹证实了dRib处理的细胞中SLC7A11的泛素化增加。此外，dRib不影响E3泛素连接酶TRIM26的表达，但剂量依赖性地降低了去泛素化酶（DUB）OTUB1在RIN5mF细胞中的mRNA和蛋白质表达水平。在大鼠胰岛中也观察到了类似的结果。

OTUB1与SLC7A11相互作用，抑制其泛素化，并防止dRib诱导的铁死亡

免疫共沉淀测定证实SLC7A11与OTUB1相互作用，但不与TRIM26相互作用。在HEK-293 T细胞中的泛素化测定表明，OTUB1过表达减少了dRib诱导的SLC7A11泛素化，这表明OTUB1通过抑制其泛素化来阻止SLC7A11降解。为了确认OTUB1水平降低是dRib诱导铁死亡的机制，我们在RINm5F细胞中过表达了OTUB1。CHX追踪测定显示，dRib加速了对照细胞中SLC7A11蛋白质的降解，而这种效应在OTUB1过表达的细胞中被消除。此外，OTUB1过表达显著恢复了dRib处理细胞的细胞内胱氨酸摄取、GSH含量和细胞活力，并降低了脂质过氧化产物和细胞内ROS水平。这些发现表明，OTUB1通过减少其泛素化来稳定SLC7A11，从而通过维持系统χc^?的胱氨酸转运来防止dRib诱导的铁死亡。

讨论

在这项研究中，我们发现，在胰腺β细胞中，dRib通过减少胱氨酸转运导致细胞内GSH耗竭来诱导铁死亡。该机制涉及由于去泛素化酶OTUB1表达水平降低，导致系统χc^?功能亚基SLC7A11蛋白质的泛素化和蛋白酶体降解增加。了解易受氧化损伤的β细胞中的铁死亡通路，将有助于阐明糖尿病的发病机制和开发新的治疗策略。

dRib诱导的β细胞死亡表现出铁死亡的所有主要特征。具体而言，观察到细胞内铁、MDA、4-HNE和脂质ROS的增加，所有这些都被铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂抑制。通过TEM证实了线粒体收缩，并且还检测到铁死亡相关分子的变化，包括ACSL4等调节因子和PTGS2、CHAC1等标志物。值得注意的是，CHAC1的上调是系统χc^?抑制诱导的铁死亡的特有特征。2-ME（已知可绕过系统χc^?并增强胱氨酸摄取）恢复了dRib引起的胱氨酸和GSH水平降低，并抑制了铁死亡。相反，DFO、Fer-1和Lip-1抑制了铁死亡，但不影响胱氨酸转运。在我们之前的研究中，我们表明过表达SLC7A11逆转了dRib诱导的胱氨酸摄取减少、GSH水平降低和细胞活力下降。在本研究中，SLC7A11过表达也抑制了β细胞中脂质ROS和脂质过氧化产物的增加。这些发现证明，dRib通过抑制系统χc^?的胱氨酸转运，导致GSH耗竭和氧化性脂质损伤，从而诱导β细胞铁死亡。

由于坏死是意外性细胞死亡，ATP从细胞死亡的早期阶段就耗竭。相反，在铁死亡（一种调节性细胞死亡形式）中，细胞内ATP一直维持到细胞死亡前夕。在我们的研究中，dRib处理的细胞在死亡前一直保持ATP水平，这与H₂O₂处理的细胞（显示早期ATP耗竭）不同。这表明dRib诱导的死亡是一个主动的、受调节的过程，与铁死亡一致。由于铁螯合剂和脂质自由基清除剂也抑制H₂O₂诱导的细胞毒性，它们单独的作用并不能确认铁死亡。然而，H₂O₂诱导的细胞死亡（以早期ATP损失为特征）不能定义为铁死亡。为了进一步验证dRib诱导死亡的铁死亡性质，我们测试了额外的铁死亡抑制剂。曲格列酮（一种ACSL4抑制剂）以及米托醌和氯吉兰（减少线粒体ROS的试剂）有效抑制了dRib诱导的脂质过氧化和细胞死亡，但对H₂O₂诱导的死亡没有影响。这些结果，结合dRib的ATP保留特性和对铁死亡抑制剂的特定敏感性，证实dRib诱导的是铁死亡，而非非特异性氧化损伤。

为了阐明dRib如何通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）促进SLC7A11降解，我们关注了两个关键酶：TRIM26和OTUB1。这样关注的原因是SLC7A11在多个水平受到调控，包括转录、转录后、翻译和翻译后。由于我们的CHX追踪测定显示dRib缩短了SLC7A11蛋白质的半衰期，我们确定SLC7A11在翻译后水平受到影响。此外，用MG132处理阻止了蛋白质表达的减少，免疫沉淀证实了SLC7A11泛素化的增加，表明dRib的机制涉及UPS介导的SLC7A11蛋白质降解。据我们所知，已知调控UPS介导的SLC7A11降解的分子是TRIM26和OTUB1。TRIM26（一种E3连接酶）增强SLC7A11泛素化并诱导铁死亡，而OTUB1（一种DUB）稳定SLC7A11并抑制铁死亡。我们的研究表明，dRib在β细胞中抑制OTUB1表达，从而促进SLC7A11降解并诱导铁死亡。这是第一份将OTUB1-SLC7A11轴与β细胞铁死亡联系起来的研究报告。鉴于OTUB1和SLC7A11在多种癌症中均上调，dRib对该通路的作用表明其作为抗癌剂的潜力。

这项研究有几个局限性。首先，我们没有评估β细胞功能（例如胰岛素分泌），因为我们的重点是细胞死亡。鉴于β细胞质量（主要由β细胞死亡决定）是糖尿病发生的主要贡献者，这并不削弱研究的意义。其次，实验仅限于细胞系和分离的大鼠胰岛；需要进行体内验证。第三，虽然我们发现dRib降低OTUB1表达，导致SLC7A11泛素化增加和铁死亡，但其确切机制——是通过经典的DUB活性还是通过非经典地抑制E2酶——仍不清楚，值得进一步研究。第四，Liu等人报道，除非施加额外的刺激如叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroxide）、erastin或胱氨酸饥饿，否则OTUB1敲除本身不会诱导细胞死亡。这表明OTUB1缺陷本身可能不足以触发细胞死亡，并且dRib诱导的铁死亡可能涉及OTUB1下调之外的额外机制，值得进一步研究。

总之，本研究证明dRib通过下调OTUB1在胰腺β细胞中诱导铁死亡，从而促进SLC7A11降解并损害胱氨酸摄取和GSH合成。过表达OTUB1或SLC7A11减轻了脂质过氧化和细胞死亡，突出了它们的保护作用。这些发现表明，靶向OTUB1–SLC7A11轴可以保护β细胞存活，并为糖尿病甚至癌症提供潜在的治疗策略。

作者贡献

Gwanpyo Koh构思并设计了该研究。Ju Young Bae、Soyeon Yoo和Eui Tae Kim进行了实验。Gwanpyo Koh、Soyeon Yoo、Ju Young Bae和Miyeon Kim分析并解释了数据。Gwanpyo Koh、Soyeon Yoo、Dongkyu Kim和Miyeon Kim撰写了手稿。Eui Tae Kim审阅并编辑了手稿。Gwanpyo Koh、Soyeon Yoo、Dongkyu Kim和Sang Ah Lee获得了资金。Gwanpyo Koh、Soyeon Yoo和Ju Young Bae确认所有原始数据的真实性。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

致谢

这项工作得到了2022年济州内分泌与糖尿病学会的研究资助，以及由韩国科学和信息通信技术部（MSIT）（RS-2024-00352590）和教育部（MOE）（RS-2023-00270936）资助的韩国国家研究基金会（NRF）的赠款支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。