母源黄酮苷元通过抑制DCL4活性诱导大豆鞍斑种皮双色模式形成的分子机制

本研究揭示了母源黄酮苷元（如槲皮素）通过种柄运输至大豆未成熟种皮中央区域，特异性抑制Dicer-like 4（DCL4）的切割活性，从而解除对查尔酮合成酶（CHS）基因的转录后基因沉默（PTGS），最终导致鞍斑种皮双色模式形成的新机制。该发现为植物组织区域性RNA沉默调控及花色苷空间分布提供了重要理论依据。

　　

SUMMARY

大豆栽培品种根据种皮颜色可分为黄色（无色）、双色（鞍斑）和黑色三类。在黄色品种中，类黄酮生物合成关键基因查尔酮合成酶的表达受到转录后基因沉默抑制。鞍斑品种中，PTGS在种脐周围的中央区域被特异性抑制，该区域成熟后呈黑色。本研究探讨了PTGS必需因子Dicer-like 4与能抑制DCL4的黄酮苷元之间的关系。在未成熟种皮中，DCL4活性在成熟后无色的区域被特异性检测到，而在成熟后变黑的区域尽管表达量无差异却未检测到活性。相反，包括类黄酮在内的酚类化合物特异性积累于成熟后变黑的区域。尤其值得注意的是，槲皮素特异性积累于未成熟鞍斑种皮的中央区域，并抑制了DCL4的切割活性。此外，类黄酮在鞍斑和黑色品种的种柄中高水平积累，而在黄色品种中不积累，且体外培养的未成熟种子其种皮中酚类化合物减少。这些结果表明，包括槲皮素在内的黄酮苷元从母体组织通过种柄运输至未成熟种皮的中央区域积累，并通过区域特异性抑制DCL4诱导了鞍斑种皮的双色色素沉着。

INTRODUCTION

RNA沉默，亦称RNA干扰介导的基因沉默，是真核生物中广泛保守的分子机制。它通过RNA指导的DNA甲基化抑制转录本身，即转录基因沉默，或通过mRNA降解抑制基因表达，即转录后基因沉默。诱导RNA沉默的小干扰RNA由双链RNA经RNase III家族内切酶Dicer切割产生。拟南芥等大多数植物拥有四种Dicer-like蛋白，分别参与特定的RNA沉默通路。DCL3产生24核苷酸siRNA，功能于TGS；DCL4产生21核苷酸siRNA，功能于PTGS。

由RNA沉默导致的性状最显著例子之一是植物组织颜色的缺失，这是由于针对色素生物合成酶基因表达的抑制所致。该现象最初在转基因矮牵牛中发现，随后在非转基因植物中也有报道。例如，在具有双色花瓣的非转基因矮牵牛品种中，CHS基因的PTGS特异性发生在花瓣的无色区域。在这种区域特异性PTGS中，串联重复的CHS基因在白色组织中产生siRNA，导致部分失色，从而诱导花瓣的双色色素沉着模式。

大豆是另一个众所周知的、其花色苷生物合成受到天然存在的PTGS在组织特异性方式下抑制的植物。大豆是全球广泛种植的重要豆类作物，是植物油和蛋白质的重要来源。栽培大豆品种根据其种皮中花色苷的分布可分为三大类：第一类为黄色品种，种皮无色，无花色苷积累；第二类为黑色品种，种皮全黑，花色苷遍布整个种皮；第三类为双色品种，色素仅积累在种脐周围的有限区域。大豆种皮花色苷的分布受I位点遗传调控。例如，含有I位点的大豆品种具有黄色种皮，含有i位点的品种具有黑色种皮，而含有iⁱ位点的品种则具有仅种脐周围有色素沉着的双色种皮。I位点与K1位点相互作用决定种皮色素分布。例如，含有iⁱ位点和隐性k1位点的品种具有鞍斑模式的双色种皮，色素扩散至种脐周围的鞍形区域。

在黄色品种的I位点和双色品种的iⁱ位点中均发现CHS基因簇内存在反向重复序列，但在具有i等位基因的黑色品种中则无。CHS siRNA在黄色和双色种皮的黄色区域特异性积累，引起CHS的内源性PTGS，抑制花色苷生物合成。这种PTGS特异性发生在种皮中。因此，类黄酮和异黄酮在种皮外部同样产生。此外，PTGS在鞍斑种皮种脐周围的黑色区域不被诱导，花色苷在该区域积累。

存在于黑色和鞍斑种皮中的花色苷和原花色素是植物中主要的次生代谢物。它们通过为花和种皮着色，以及保护植物体免受害虫、食草动物、紫外辐射和氧化应激的侵害，在植物生存中发挥有利作用。类黄酮通过苯丙烷途径在细胞质中以前体苯丙氨酸为起始原料生物合成，以非糖苷形式存在。经糖基化后，这些化合物以糖苷形式储存于液泡中。

类黄酮具有蛋白质结合能力，并能抑制动物消化酶活性。此外，我们先前的研究表明，类黄酮在体外可抑制两种拟南芥Dicer（DCL3和DCL4）的切割活性。其中DCL4对PTGS至关重要。基于这些前期研究，我们假设鞍斑种皮种脐周围中央区域特异性积累的类黄酮及其后续对DCL4的区域特异性抑制，导致了PTGS的区域特异性抑制和花色苷生物合成的恢复。

本研究使用三个大豆品种来探究未成熟种皮在种子成熟过程中类黄酮积累与DCL4活性之间的相关性。在未成熟鞍斑种皮中，成熟后变黑的种脐周围中央区域显示出高水平的黄酮苷元积累，并对DCL4活性表现出强效抑制。此外，类黄酮在鞍斑和黑色品种的种柄中高水平积累，而在黄色品种中不积累，且体外培养的未成熟种子其种皮中酚类化合物减少。这些结果支持了上述关于鞍斑种皮双色色素沉着的假说，即从母体组织通过种柄运输并积累在未成熟种皮中央区域的黄酮苷元，通过区域特异性抑制DCL4诱导了双色模式。

RESULTS

PTGS仅在未成熟鞍斑种皮的周边区域被诱导，而在种脐周围成熟后色素沉着的中央区域被抑制

本研究使用了三个大豆品种：具有鞍斑种皮的Shinano-Kurakake、具有黄色种皮的Enrei和具有黑色种皮的Tanbaguro。由于有报道称黄色种皮在种子成熟早期积累源自CHS基因的siRNA，因此根据种子鲜重将未成熟种子分为三个发育阶段。这些未成熟种子缺乏可见的色素积累；无法肉眼判断SK鞍斑种皮中色素沉着与否的区域。因此，将成熟种子中显示色素沉着的种脐周围区域和远离种脐的无色素区域进行解剖用于后续实验。在未成熟En种子的种皮中检测到源自CHS基因的21核苷酸siRNA，在SK种子的PR中也检测到，但在SK种子的CR中未检测到。由于21核苷酸siRNA是PTGS的标志，因此PTGS仅在鞍斑大豆种皮的PR中被诱导，而在成熟后变黑的CR中被抑制，这与先前报道一致。

未成熟鞍斑种皮的周边区域检测到切割活性，而中央区域未检测到

具有鞍斑模式种皮的双色大豆品种SK，其花色苷仅积累在种脐周围的限制区域。虽然先前研究表明双色大豆种皮无色的原因是内源性PTGS抑制了CHS基因的表达，但产生这种双色模式形成的分子机制仍不清楚。由于我们最近报道了DCL4的切割活性在大豆叶片中被抑制，且黄酮苷元在体外抑制DCL4活性，我们假设在鞍斑大豆品种中，DCL4活性在成熟后发育色素的种脐周围种皮中被特异性抑制。为验证此假设，我们使用来自SK、En和Tan的种皮、子叶和叶片制备的粗提物进行了体外切割活性检测。在三个品种的种子成熟过程中检测了DCL3和DCL4的切割活性。在三个品种的子叶中均观察到DCL3和DCL4的强切割活性。然而，在叶片中未检测到DCL3或DCL4的切割活性。值得注意的是，在En的种皮和SK的PR中观察到了DCL3和DCL4的切割活性，而在成熟后色素沉着的SK的CR和Tan的种皮中未检测到切割活性。SK的PR中检测到的DCL4活性低于En种皮中检测到的活性，且两个品种中DCL4活性均随种子成熟而降低。SK和En种皮中DCL3和DCL4基因的转录水平在种子成熟阶段之间或鞍斑品种种皮区域之间均未检测到显著差异。这些结果支持了DCL4活性水平对于调控大豆种皮花色苷积累至关重要的假设。

来自未成熟鞍斑种皮中央区域的粗提物抑制切割活性

在鞍斑品种SK的未成熟种皮CR中未观察到切割活性。我们假设DCL抑制剂的积累导致了鞍斑品种SK中切割活性的区域特异性抑制。为证实此假设，使用来自未成熟SK种皮CR的粗提物、未成熟En种皮的粗提物以及En提物与CR-SK提物的1:1混合物进行切割实验。通过混合En和CR-SK提物，观察到与稀释的En提物相比，DCL3和DCL4活性显著降低。该结果表明切割抑制剂积累在未成熟SK种皮的CR中。

未成熟鞍斑种皮中央区域观察到类黄酮的高积累

CHS基因对类黄酮生物合成至关重要，在大豆有色种皮中显著表达。一致地，花色苷和无色或淡黄色类黄酮积累在大豆品种的黑色种皮中。在我们先前的研究中，各种类黄酮抑制了拟南芥DCL3和DCL4的切割活性。我们假设类黄酮会特异性积累在大豆种皮的色素沉着区域，作为DCL4的抑制剂。为验证此假设，通过Folin–Ciocalteu法测定了三个大豆品种种皮中的总酚类化合物。由于聚乙烯聚吡咯烷酮能特异性吸附类黄酮，本研究中将未处理提取物与PVPP处理提取物中的总酚类化合物之差视为类黄酮含量。

未成熟En种皮含有低水平的酚类化合物。相反，高水平的酚类化合物积累在未成熟SK种皮的CR中，其中大部分为类黄酮。这些结果表明，与花色苷一起在苯丙烷途径中生物合成的高浓度类黄酮，积累在未成熟SK无色种皮的CR中，该区域随种子成熟而变黑。在未成熟SK种皮的PR中检测到较低水平的类黄酮。这些结果表明酚类化合物的积累与未成熟鞍斑种皮中的切割活性水平呈负相关，提示体内切割活性可能受到类黄酮的抑制。

黑色品种Tan具有均匀黑色的种皮，种子成熟时产生花色苷色素。预期Tan积累的酚类化合物浓度应等于或高于鞍斑品种SK的CR中的水平。然而，出乎意料的是，Tan种皮中酚类化合物的浓度在所有种子成熟阶段均低于SK的CR。因此，将Tan的未成熟种皮也分为中央和周边区域，并测量了每个区域的总酚含量。这些结果表明，Tan的CR中酚类化合物的浓度与SK的CR中的浓度相当。这些结果也表明，在鞍斑和黑色品种的未成熟种皮中，从种脐周围的CR到PR存在酚类化合物的浓度梯度。

未成熟种皮中的类黄酮抑制切割活性

为检验粗提物中的类黄酮是否能抑制DCL的切割活性，使用去除PVPP结合化合物的粗提物进行切割实验。结果表明，通过PVPP处理，从SK的CR以及Tan提物制备的粗提物中，DCL3和DCL4的切割活性显著恢复。这些结果表明，在后期色素沉着的未成熟种皮区域中的类黄酮在体外抑制了切割活性。

未成熟鞍斑种皮中央区域黄酮苷元的高积累

通过液相色谱-质谱联用进行定量和定性分析，以鉴定积累在未成熟大豆种皮中的类黄酮分子种类。该分析靶向了八种黄酮苷元、它们的糖苷以及一种表儿茶素二聚体。检测到的类黄酮列表见表S1，代表性化合物显示于图6B。由于该分析方法无法区分儿茶素和表儿茶素，故将两者合并表示为儿茶素/表儿茶素。

槲皮素苷元显著积累在SK和Tan的未成熟种皮中。在SK的未成熟种皮中，槲皮素苷元在CR中的积累远高于PR。槲皮素糖苷及其苷元的分布显示出相似的趋势。此外，儿茶素/表儿茶素苷元显著积累在SK和Tan的未成熟种皮中。原花青素B2也显示出与儿茶素/表儿茶素相似的分布。这些结果表明，类黄酮，包括其苷元，特异性且高水平地积累在未成熟种皮的那些随种子成熟而显示色素沉着的区域，即使未成熟种皮仍为无色。一个公认的事实是，类黄酮在细胞质中利用苯丙氨酸作为起始原料进行生物合成，并以苷元形式存在。当类黄酮被转运至液泡时，在细胞质中发生糖基化。这意味着槲皮素和/或儿茶素/表儿茶素苷元可能在体内直接与细胞质中的DCL4相互作用。总的来说，这些发现表明，在未成熟SK种皮的CR和Tan的未成熟种皮中高水平积累的槲皮素和儿茶素/表儿茶素，可作为DCL4的抑制剂。

槲皮素在体外抑制DCL4的切割活性

如图6B所示，槲皮素、儿茶素/表儿茶素以及一种槲皮素糖苷特异性积累在未成熟SK种皮的CR中。我们试图确定这些类黄酮是否具有抑制DCL4切割活性的活性。我们使用来自未成熟En种皮的粗提物作为酶组分，并以商品化类黄酮作为抑制剂，进行了切割实验。如图所示，槲皮素特异性抑制了DCL3和DCL4的切割活性，但表儿茶素和槲皮素糖苷则没有。

本实验中使用的槲皮素浓度在体内观察到的生理范围内。这些结果表明，积累在未成熟SK种皮CR中的槲皮素具有抑制DCL4切割活性的活性。因此，槲皮素是形成大豆鞍斑双色模式的关键化合物。

鞍斑和黑色品种的种柄中类黄酮高水平积累，而黄色品种则不然

上述结果表明，未成熟种皮中DCL4的切割活性受到黄酮苷元的抑制，特别是在种子成熟时色素沉着的区域，从而抑制了这些区域中CHS基因的PTGS。接下来，我们关注触发PTGS抑制和类黄酮合成起始的机制。基于酚类化合物在未成熟种皮中从种脐周围的CR到PR形成浓度梯度的结果，我们关注种柄，种柄是连接种子与母体植物的器官，被认为是营养物质或代谢物从母体组织运输到种子的唯一途径。也有报道称，积累在大豆种子中的异黄酮既是自身合成的，也是从母体植物组织运输而来的。我们假设母体产生的黄酮苷元从母体组织运输而来，并从进入点形成浓度梯度。我们量化了三个大豆品种种柄中的总酚类化合物。有色品种SK和Tan所含的酚类化合物约为无色品种En的六到八倍。种柄总酚类化合物中类黄酮的百分比在En中为1.0%，在SK中为19%，在Tan中为34%。这些结果表明，从母体组织运输到种皮的酚类化合物的量与PTGS抑制程度相关。这也提示通过种柄运输至种皮的酚类化合物可能触发未成熟鞍斑种皮中DCL4活性的抑制，以及随后通过抑制PTGS而启动的类黄酮生物合成。因此，尽管黄色和鞍斑品种的基因组中均含有诱导RNAi的位点，但黄色品种En具有完全无色的种皮，因为类黄酮几乎不从母体组织供应。相反，鞍斑品种SK在种脐周围的中央区域具有色素沉着区域，该区域的PTGS可能被母体组织输入的黄酮苷元所抑制。

体外培养的鞍斑品种未成熟种子其种皮中酚类化合物减少

为确认类黄酮从母体组织向种皮的运输，我们比较了体外培养的离体未成熟种子与在豆荚中生长的对照种子在鞍斑大豆品种SK的未成熟种皮中酚类化合物的含量。在开花后7–10天或12–14天将未成熟SK种子从豆荚中取出，在合成琼脂培养基上培养7天。测定种皮中酚类化合物的浓度。体外培养的种子表现出比对照种子更慢的生长速率，体外培养7天后未观察到种子鲜重的显著增加。通过将酚类化合物浓度乘以种皮各区域的平均鲜重来估算每种皮的总酚类化合物含量。在体外培养后，7–10 DAF和12–14 DAF种子组的种皮中总酚类化合物含量均显著降低。这些结果表明酚类化合物是从母体植物运输到种皮的。

鞍斑种皮双色模式形成模型

DCL4的切割活性受到从母体组织运输至鞍斑大豆品种未成熟种皮种脐周围CR的黄酮苷元的抑制。这种抑制解除了种皮CR中针对CHS基因的PTGS，使得该区域发生花色苷/类黄酮的从头生物合成。产生的黄酮苷元加强了对DCL4的抑制，以维持CR中的花色苷生物合成，导致花色苷/类黄酮生物合成和DCL4抑制的前馈调控。相反，DCL4的切割活性和PTGS在鞍斑种皮的PR中得以维持，该区域在整个种子成熟过程中保持无色素沉着。因此，由DCL4和黄酮苷元构成的空间前馈调控导致了鞍斑大豆品种种皮的双色模式。

DISCUSSION

虽然积累在大豆种皮中的花色苷对大豆产品加工有不良影响，但在人类健康中也具有促进健康的作用。因此，种皮色素沉着是大豆最重要的农艺性状之一，因为它影响该作物的商业价值。在含有I和iⁱ等位基因的黄色和双色品种中，花色苷的从头生物合成受到天然内源性PTGS的调控。然而，导致鞍斑品种双色色素沉着的PTGS空间调控分子机制仍不清楚。由天然内源性PTGS诱导的植物组织双色色素沉着不仅发生在大豆中，也发生在其他开花植物中。这些双色植物中大多数PTGS靶向类黄酮生物合成途径上游的CHS基因。因此，这些植物中的PTGS不仅抑制花色苷，也普遍抑制类黄酮的生物合成。

我们假设积累在未成熟鞍斑种皮CR中的黄酮苷元参与了转录后CHS基因沉默的区域特异性抑制。支持这一假设的是，我们展示了未成熟鞍斑种皮CR中DCL4活性的抑制、Dicer抑制剂的积累以及黄酮苷元的积累，并通过PVPP处理去除类黄酮后体外切割活性的恢复。其中一种黄酮苷元槲皮素在体外抑制了DCL4的切割活性。此外，我们发现类黄酮在鞍斑和黑色品种的种柄中高水平积累，而在黄色品种中不积累，且体外培养的鞍斑未成熟种子其种皮中酚类化合物减少，这表明从母体植物组织供应的黄酮苷元形成浓度梯度，导致未成熟鞍斑种皮中从种脐中心到周边的DCL4抑制梯度差异。总体而言，我们提出母源黄酮苷元对DCL4活性的局部抑制促进了鞍斑大豆品种种脐周围种皮的色素沉着。

PTGS在细胞质中运作，其组分包括DCL4和靶标mRNA均可在此获得。类黄酮在细胞质中生物合成，并以糖苷形式储存于液泡中。可以推测，本研究中在有色品种未成熟种皮中检测到的槲皮素很可能存在于细胞质中。槲皮素在未成熟鞍斑种皮CR中的高水平积累及其对DCL4的抑制活性表明槲皮素参与了体内切割活性的抑制。类黄酮糖苷必须储存于液泡中。在我们的切割实验中，制备粗提物时液泡很可能被破坏。因此，液泡中隔离的类黄酮糖苷以及细胞质中的黄酮苷元都可能存在于酶组分中。然而，切割活性的抑制能力存在于槲皮素中，而不存在于其糖苷芦丁中。

在SK种皮的周边区域，负责产生21核苷酸siRNA并因而发生PTGS的DCL4活性仅在D1阶段被检测到。先前研究报道，在鞍斑和黑色大豆品种中，种皮中CHS基因表达水平随种子成熟而下降。那些报告连同我们的结果表明，成熟种皮中色素沉着的发生或缺席是由种子发育早期CHS基因的表达决定的。因此，由于DCL4负责CHS siRNA的产生，其在此阶段的切割活性极大地影响了成熟鞍斑种子的色素沉着。具有i等位基因的黑色品种Tan，其基因组中没有触发PTGS所必需的CHS基因反向重复序列。因此，无论其DCL4活性如何，靶向CHS基因的PTGS在黑色品种中均不发生。

槲皮素不仅抑制DCL4的活性，也抑制DCL3的活性。该结果与使用未成熟种皮进行的切割实验发现一致，在鞍斑大豆的CR区域既未检测到DCL4也未检测到DCL3活性。这些结果表明，在积累槲皮素等黄酮苷元的组织中，PTGS和TGS可能均受到抑制。

有报道称黄酮苷元可长距离移动，例如从地上部到根部。例如，在拟南芥中，黄酮苷元以光依赖方式在地上部合成，并被运输并积累在根尖。类似地，有报道称异黄酮从母体组织运输到大豆种子的发育胚中，硫代葡萄糖苷在芸苔属物种中在其他植物器官合成后输送至种子。种子通过种柄附着在豆荚上，豆荚中的维管束通过种柄延伸至种皮。由于种皮与未成熟子叶之间没有维管束连接，种皮代表了营养物质通过共质体途径从母体组织到种子的最终点。因此，从母体组织运输到发育胚的营养物质可能穿过种皮。在本研究中，为阐明黄酮苷元是否从母体组织运输到种皮，我们关注种柄以量化酚类化合物。我们在双色和黑色品种的种柄中检测到比黄色品种En更高含量的酚类化合物。此外，有色品种种柄中类黄酮在总酚类化合物中的比例也更高。这些结果表明，类黄酮不仅在种皮中生物合成，也在鞍斑和黑色品种中从母体组织运输而来，而在黄色品种中则不然。

为了进一步了解类黄酮从母体组织向种皮的运输，进行了一项研究，考察体外培养未成熟种子对种皮中类黄酮浓度的影响。结果显示，体外培养的未成熟SK种子种皮中总酚类化合物和类黄酮的含量减少。这提供了明确证据，表明从母体植物运输营养物质是类黄酮在大豆种皮中积累的一个因素。特别是，在7–10 DAF期间培养的未成熟SK种子，其种皮CR中的类黄酮相对于对照组有所减少。这一结果表明，类黄酮从母体植物向种皮的运输在种子发育的早期阶段即已开始。此外，这一结果与在D1阶段未成熟SK种皮CR中DCL4活性已被抑制的观察结果一致。从母体组织通过种柄运输至CR的黄酮苷元，很可能在未成熟SK种皮中从CR扩散到PR。这与在PR中检测到一定含量的类黄酮是一致的，而在PR中类黄酮的从头合成受到PTGS抑制。此外，类黄酮从CR到PR的扩散也可以解释为何在SK未成熟种皮的PR中观察到DCL4活性随种子发育而下降。

我们提出了一个假设机制，用于解释鞍斑大豆种皮中PTGS抑制的启动，该机制由从母体植物组织运输的包括槲皮素在内的黄酮苷元触发，并通过未成熟种皮中从头生物合成的黄酮苷元进行前馈增强和维持PTGS抑制。在含有I等位基因的黄色大豆品种中，较少的类黄酮从母体组织运输到未成熟种皮，并且DCL4活性在整个种皮中得以维持。因此，在种子成熟过程中，PTGS在整个种皮中得以维持，类黄酮的生物合成被完全抑制。相反，在含有iⁱ等位基因的双色鞍斑品种中，大量类黄酮通过种柄从母体组织运输到未成熟种皮。运输来的类黄酮抑制DCL4的切割活性，导致PTGS的抑制和种脐周围未成熟种皮中类黄酮生物合成的恢复。通过种柄将类黄酮运输至种皮与在黑色品种Tan中观察到酚类化合物积累集中在中央区域的结果一致。在鞍斑品种中，认为在未成熟种皮CR中从头生物合成的黄酮苷元以前馈方式抑制DCL4的切割活性。这种抑制在PTGS曾被抑制的区域被不可逆地维持，导致种皮具有清晰的双色模式。在鞍斑品种中，色素沉着总是出现在种脐周围的限定区域。这一现象可能归因于由于类黄酮通过种柄从母体组织运输而形成的从中央区域到周边区域的类黄酮浓度梯度。本研究首次报道了将PTGS诱导的双色模式形成与类黄酮，特别是从母体植物体运输而来的类黄酮联系起来。这些发现将有助于阐明植物组织中通过组织间类黄酮运输对PTGS诱导和抑制进行空间调控而形成双色模式的机制。