酰基肽水解酶的配体结合混杂性研究：一种解毒性丝氨酸水解酶的结构解析与功能重塑

本综述通过冷冻电镜结构解析，揭示了哺乳动物酰基肽水解酶（APEH）与氯甲基酮抑制剂（AcACMK）、有机磷农药（dichlorvos）和苯磺酰氟（AEBSF）等经典丝氨酸蛋白酶配体的复合物结构。研究发现APEH活性中心存在独特的Pro506介导的氧阴离子环（oxyanion-loop）构象可塑性，该结构特征通过部分失活态与催化态之间的动态转换，将经典丝氨酸蛋白酶装置转化为具有广谱特异性的水解中心，从而赋予其解毒酶功能（如降解氧化损伤蛋白、代谢丙戊酸葡萄糖醛酸苷VPA-G等）。这一发现为开发基于APEH的有机磷暴露生物标志物、认知增强药物和癌症治疗策略提供了结构基础。

　　

Abstract

酰基肽水解酶（APEH）作为丝氨酸水解酶家族成员，不仅参与蛋白质代谢调控，还能结合并处理异常底物，发挥解毒功能。为探究其混杂特异性的结构基础，本研究解析了哺乳动物APEH与氯甲基酮抑制剂（AcACMK）、有机磷农药敌敌畏（dichlorvos）及苯磺酰氟（AEBSF）的冷冻电镜结构。这些复合物具有重要生理意义：AcACMK衍生物可通过抑制APEH诱导凋亡，而OP复合物可作为OP暴露的生物标志物并与认知增强相关。研究发现在水解酶结构域中，独特的Pro506残基打破β链连续性，使活性中心松弛为部分失活但更宽敞的构象，将经典丝氨酸蛋白酶装置转化为兼具高效性与广谱特异性的水解中心，从而区别于其他APEH同源物及共享类似折叠的丝氨酸α/β水解酶。

1 INTRODUCTION

丝氨酸水解酶的功能研究已近百年，其催化三联体（Ser-His-Asp）机制和底物特异性主要由底物结合口袋的几何与静电性质决定。S9亚家族寡肽酶（如APEH）通过结构域动态组装调控底物进出活性中心。APEH核心生理功能是去除寡肽和蛋白质N末端的N-乙酰化氨基酸，从而控制损伤/错误折叠蛋白的蛋白酶体降解，属于解毒酶家族。其活性中心可塑性支持诱导契合与构象选择机制，例如APEH是唯一可水解丙戊酸代谢物VPA-G的哺乳动物丝氨酸水解酶，且能被碳青霉烯类抗生素抑制，这一特性已被用于VPA过量的急救治疗。近期研究还发现APEH在抗疟疾前药激活中起关键作用。尽管已有猪源APEH（pAPEH）的自由态和碳青霉烯抑制态结构，为进一步理解其底物结合模式，本研究聚焦其与经典丝氨酸蛋白酶抑制剂的复合物结构。

2 RESULTS

2.1 APEH与氯甲基酮抑制剂的复合物结构

AcACMK共价结合pAPEH的Ser587和His707，形成乙酰丙氨酰甲基半缩酮（AcAMHK）衍生物。与自由态相比，氧阴离子环（Gly509所在环）向配体移动约0.5?，His707环也靠近0.5?。然而，AcAMHK的四面体氧原子与氧阴离子位点（Gly509和His588的骨架酰胺）距离较远（3.9?和3.6?），未能形成强氢键，表明活性中心在配体结合后仍比典型丝氨酸蛋白酶更松弛。

2.2 氧阴离子环位移的催化意义评估

比较古菌APEH（PhAPEH和ApAPEH）的CMK复合物结构发现，其氧阴离子环在配体结合前后无显著位移，且预先形成紧凑的活性中心。QM/MM计算表明，pAPEH中氧阴离子环仅1?的位移即可显著影响反应能垒：在直接形成氢键的模型中，四面体产物态能量更低（-44.1 kcal/mol），而水分子插入的松弛模型则不利（-17.8 kcal/mol）。功能实验显示古菌APEH仅特异性水解Ac-Leu-pNA，且不被美罗培南抑制，进一步验证哺乳动物APEH因构象可塑性具备更广的底物谱。

2.3 APEH的有机磷和苯磺酰氟复合物

敌敌畏水解后形成的二甲氧基磷酸酯（DMP）共价结合Ser587，其游离氧原子与Gly509-NH形成氢键（2.7?），但另一个氧阴离子位点（His588-NH）仍距离较远。与CMK复合物不同，DMP结合导致His707环远离活性中心0.8?。AEBSF复合物局部分辨率较低（2.9?），但明确其共价结合Ser587，而非像二肽基肽酶4（DPP-IV）那样结合邻近酪氨酸。

2.4 Pro506对氧阴离子环构象的作用

分子动力学模拟显示，P506L突变使氧阴离子环前移，催化Ser587的溶剂可及表面积（SASA）从26?2降至20?2，活性中心变窄。这表明Pro506通过破坏核心β片层的连续性，增强氧阴离子环灵活性，进而扩大底物结合空间。

3 DISCUSSION

酶催化常伴随构象变化，如血红蛋白中0.4?的组氨酸位移即可影响氧亲和力。pAPEH的活性中心在配体结合时呈现“锁-钥”与“诱导契合”双重特性：其浅疏水S1口袋容纳小侧链（如Ala、甲氧基），而大基团（如美罗培南的羟乙基）则通过单体侧开口进入。关键特征在于氧阴离子环和His环的协同位移：CMK结合时二者均靠近，而庞大配体（如OPs）则使His环远离。这种可塑性使pAPEH能处理结构多样的损伤蛋白和异源物质（如VPA-G、碳青霉烯）。与人类其他α/β水解酶（如AChE、BChE、CES1）相比，pAPEH的活性中心最宽敞（d1_Ser-His=10.3?, d2_{Ser*-NHoxyanion}=7.1?），且配体结合后尺寸变化最大。古菌APEH及多数S9家族酶缺乏Pro506，其活性中心更刚性。自然突变T541M可能通过影响氧阴离子环运动降低酶活，而其他功能缺失突变多位于四聚化界面。

4 CONCLUSION

APEH因其多功能性成为癌症治疗、器官损伤 biomarker 和OP暴露监测的潜在靶点。本研究揭示其广谱特异性的结构基础：Pro506介导的β链断裂导致活性中心松弛，结合浅S1口袋和氧阴离子环的顺式Pro510刚性元件，共同塑造了易于接近且可再激活的催化装置。这种微小的结构差异（0.5–2.5?）体现了自然进化对酶混杂性的“智能设计”，为人工酶设计提供了范例。

5 MATERIALS AND METHODS

猪肝APEH纯化后与AcACMK、敌敌畏或AEBSF孵育，经冷冻电镜解析复合物结构（分辨率2.65–3.19?）。QM/MM计算采用B3LYP/6-31G*方法，MD模拟使用AMBER-ff99SBildn力场。结构比较基于水解酶结构域核心β片层与催化Ser后螺旋的骨架叠合。