纳米粒子稳定的双连续结构在尿素控释中的作用：肥料浓度调控与农业应用探索

本文系统探讨了基于可生物降解聚合物与羟基磷灰石纳米粒子（HA NPs）构建的双连续结构（bijels）作为尿素控释载体的创新策略。研究揭示了肥料浓度对释放动力学的关键影响，通过在不同介质（水体、硅藻土、土壤）中的释放实验及小麦生长研究，证实该系统能显著延缓尿素释放（土壤中达15天以上），提升植物生长指标（株高、根长、生物量），为绿色农业提供了低成本、无溶剂、可同时负载亲/疏水分子的高效肥料递送平台。

　　

1 引言

肥料在提供植物生长所需养分方面至关重要，其中尿素因其高氮含量和低成本成为最常用的氮基肥料之一。然而，尿素的高亲水性导致其在土壤中易流失，造成环境污染和资源浪费。控释系统作为农业领域的新兴策略，能够延长肥料和农药的作用时间，优化使用效率。近年来，利用从生物材料作为药物递送系统的知识开发的缓释肥料显示出良好前景。缓释肥料通常将肥料分子包覆或封装，使其能够以受控动力学长时间释放。

在众多策略中，水凝胶因其保水、膨胀、缓释、生物相容性和可生物降解性等关键特性发挥着重要作用。然而，许多技术如铁基金属有机框架、等离子体、纳米粒子等虽能提升性能，但经济成本过高。关键问题在于使用对环境有毒的分子（如表面活性剂和溶剂）以及缺乏生物降解性和高生产成本，限制了缓释肥料的可扩展性。因此，生产能够提高标准肥料性能而无环境和成本缺陷的尿素缓释系统是一大挑战。

本研究专注于优化能够维持和控制肥料释放的设备，考虑使用可生物降解和低成本材料。近年来，我们开发了bijels，这是一种特殊的Pickering乳液，凭借其双连续结构，可同时负载亲水性和疏水性分子，用于医学和农业等不同领域的控释系统。

2 结果与讨论

2.1 尿素负载设备的合成与表征

用于合成负载尿素（PCL-U 1 M）的双连续设备的程序如图1a所示。选择ε-己内酯（ε-CL）作为单体，因其能在本体条件下聚合，产生广泛用于多个工业领域的疏水性可降解聚合物。考虑到作物生产所用材料还需满足成本条件，该聚合物的适用性已得到大量论文和专利的证实。添加乙醇作为引发剂，1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯（TBD）作为催化剂，用于ε-CL的开环聚合，形成聚己内酯（PCL）。随后，在控制温度下，将尿素（1 M）溶于水（与PCL体积比为1:1）在搅拌下加入。

为形成适当的设备（PCL-U 1 M），避免两个不相容相分离，需使用胶体作为稳定剂，如Pickering乳液中的情况。基于羟基磷灰石的纳米粒子（HA NPs）首先按照实验部分描述的方法制备。它们的尺寸、形状和化学成分经检查与先前研究一致。两相的正确结合，得益于HA NPs的存在，使得形成聚合物网络，其中水和尿素被包裹而无 coalescence。

获得的结构随后从注射器中收集，无水分损失，保证尿素的完全负载（图1b）。通过傅里叶变换红外（FT-IR）光谱观察所得设备的化学结构（图1c）。两条光谱均显示约3400 cm^?1处羟基的宽吸收带，构成羟基磷灰石结构，以及HA中已存在的CO₃^2?。此外，2950和2860 cm^?1处的信号归属于羟基的C─H不对称和对称伸缩，表明己内酯的存在。1730 cm^?1处的峰与所用聚合物相关，特别是酯的羰基伸缩振动（图1c中的2）。1250至1100 cm^?1之间的光谱区域对应于对称和不对称C─O─C伸缩振动（图1c中的3）。尿素的存在从≈3190 cm^?1处的信号可见，对应于NH伸缩（图1c中的4）。

进行DSC热分析以了解尿素在聚合中的作用（图1d）。仅观察到若尿素引入3D网络，会有微小偏移，导致熔点降低。测量的温度在聚酯典型范围内，特别是聚己内酯，表明负载的溶质只能部分影响聚合。此外，仅存在于PCL-U 1 M中的133°C处吸热峰对应于设备中尿素的存在。

聚合物相的表征通过凝胶渗透色谱（GPC）结果报告在表1中。可见，尿素的存在仅部分改变分子量和多分散指数，与讨论的DSC热谱图一致。最终设备PCL-U 1 M显示出超过一个月的高稳定性（数据未显示），得益于聚合允许形成固体基质。此外，PCL-U还表现出溶胀行为，能够在其结构中保留水而不溶解，这不是疏水性聚合物的典型特性。

PCL-U 1 M设备的内部多孔结构和相应的元素分析（EDX光谱）如图2所示。图2a–d显示了不同放大倍数下的聚合物多孔结构，并通过EDX光谱（图2e）确认，其中O和C信号对应于聚己内酯，N信号对应于尿素。图2c（插入）中突出显示了与先前工作一致的基于HA的NPs的小结构。能量色散X射线（EDX）分析（图2f）证实了羟基磷灰石在白色箭头处的存在，具有P和Ca信号。此外，获得的致密结构负责最终系统的高稳定性，作为固体基质的一部分。

在评估PCL-U 1 M结构的高度孔隙度后，我们测量了在不同浓度下肥料分子通过网络的扩散率。考虑的两相构成双相多孔结构，如图3a示意图所示，其中白色对应于聚己内酯，绿色对应于溶于水的尿素。两域界面处的点代表基于HA的NPs，负责整个结构的稳定。确实，如Pickering乳液中，它们避免了疏水和亲水域的聚集，否则会导致相分离和3D结构破坏。

使用核磁共振（NMR）技术（特别是扩散有序光谱DOSY方法）通过增加强度的脉冲场梯度（PFG）量化分子运动通过扩散（图S6，支持信息）。DOSY实验产生的2D图谱如图3b所示。该图谱证实分析的样品呈现双连续结构，具有两个明确定义的分离域，一个用于聚己内酯，另一个用于水（D₂O）。聚合物呈现平均扩散系数为7.3 × 10^?11 m² s^?1，而水的扩散系数为≈1.3 × 10^?9 m² s^?1（不同尿素浓度的值报告在表2中）。该值与文献中报道的298 K时水的系数一致。

图谱中可见的第三个区域与尿素分子相关，存在于水相中，其扩散系数（表2）显著低于纯水中的尿素。确实已知在水中，尿素减缓水分子扩散，表明水网络在尿素存在下变得更僵硬，导致水分子运动减慢。即使在高尿素浓度（高达8 M）下，大多数水分子的取向动力学与液态纯水相同，表明尿素对这些分子的氢键影响可忽略。然而，一小部分水分子被尿素强烈固定，显示取向动力学比体相液态水慢六倍以上。解释是固定的水分子与尿素紧密关联，形成特定的尿素-水复合物。该结果在PCL-U样品中也可见，再次强调亲水和疏水相存在于不同且 distinct的域中。

不同尿素浓度导致尿素扩散系数和水扩散系数的差异，因为它们属于同一相（图3a中的绿色）。特别是，增加水域中分子数量，由于系统内存在的相互作用，涉及的两个分子（尿素和水）的分子运动增加。确实常见溶质/溶剂或溶质/溶质相互作用可影响分子运动，修改相应的扩散系数，因此这些系数依赖于溶质浓度。

增加尿素浓度，水扩散性的变化很小，因为形成尿素-水复合物。确实，尿素-水复合物是分子关联，其中水分子与尿素形成氢键，创建结构化网络，具有围绕尿素分子羰基和胺基的特定排列，影响水性质并可能稳定不同的水-(尿素)n簇。这些簇非常有效地阻碍系统内水的运动，作为氢键水网络结构变化的结果，因为它变得更刚性。此外，尿素在双连续结构中的扩散性随尿素浓度增加而增加，如液态水中发生的情况。不同尿素浓度负载的PCL-U样品对应的图谱可见于图S7和图S8（支持信息）。

2.2 从PCL-U控制释放尿素

首先使用水作为释放介质研究从PCL-U设备释放尿素负载的能力，结果如图4a,b所示。PCL-U系统负载不同浓度尿素：1、3和5 M。呈现的数据绘制为累积释放百分比（尿素校准线在图S2，支持信息）。释放介质未搅拌，这是作物生产的典型条件。释放延长超过15天，适用于PCL-U在1、3和5 M尿素浓度。

图4b中，尿素释放针对时间平方根绘制。点线性（虚线）表明尿素通过3D聚合物基质的Fickian扩散。可见突释效应，代表不受控释放，因此是控释设备的主要缺点，约为25%，考虑尿素浓度的贡献无大差异。这是预期的，考虑到尿素的高亲水性，通常从制剂产品中快速释放。

为完整性，还考虑了搅拌条件下的情况，即使它更典型于生物环境而非农业环境（图S9，支持信息）。在这种情况下，释放快速，几乎所有三种考虑的尿素浓度在2天后完全释放。这是进一步证明尿素的高亲水性，连同搅拌给出的高浓度梯度，不能保证适当的释放速率，因此掩盖了在其他释放情况中可见的扩散性差异，并由表2突出显示。

为理解PCL-U系统在农业中的适用性，使用惰性固体（硅藻土）作为释放介质测试尿素释放。硅藻土，也称为硅藻土，因其惰性性质和易于与分析物分离而被选择。图5a呈现了不同浓度尿素在硅藻土中的释放曲线。释放延长超过15天，适用于PCL-U在3和5 M尿素，而PCL-U 1 M的释放在大约一周内完成。如预期，释放与水中测试的可比，由于尿素对固体介质的高亲和力。

注意到的主要差异是，在这种情况下，突释效应的贡献远低于水中观察到的情况。确实，Fickian扩散从一开始就发生，从图5b可见。强调尿素通过载体的扩散性的斜率在分析的三种条件之间表现出差异。特别是，PCL-U 1 M的斜率更高，在前6天有线性区域，而在更高浓度下，可见4天。考虑到尿素的高亲水性和对固体介质的高亲和力，收集的结果强调PCL-U可以有效控制和维持尿素释放，代表这些系统的关键优势。这是可能的，考虑到PCL-U的致密多孔结构，从图2可见，它可以对尿素的快速逃逸创造良好障碍。确实常见亲水分子，如果不被限制，可以快速从负载它们的载体中逃逸。

从土壤中从PCL-U 1、3和5 M尿素的释放呈现于图6a。在这种条件下，突释效应代表货物的不受控释放，约为14–16%。这种现象的责任在于更靠近表面的尿素分子，因此可以到达释放介质。该值几乎不依赖于负载的尿素浓度，因为表面的分子在三种考虑的情况中几乎相同。所有三种情况的释放速率受控并维持超过18天。释放动力学较慢，由于土壤的存在，基质具有更高紧实度和更低孔隙度，特别是在PCL-U 1 M的情况下。在3和5 M的情况下，无大差异可见，由于在这些条件下尿素的更高扩散系数可以掩盖作为释放介质的固体基质之间的差异。

考虑线性区域，如所说，代表纯Fickian扩散，可以对硅藻土情况做类似考虑（图6b）。明显PCL-U设备可以长时间控制和维持尿素释放。这是一个好结果，因为通常尿素一旦从制剂设备释放，不容易维持。如观察，在所有三种情况中，曲线表现出Fickian行为，强调尿素浓度对释放机制类型的影响极小，仅影响动力学。这表明受影响的是扩散系数，当转移到固体介质（硅藻土）时减小，并在更复杂的系统如土壤中进一步减小。

有效最终释放时间取决于最终结构、选择的肥料或农药类型及其浓度。在这项工作中，我们专注于尿素浓度，强调1 M尿素释放更快，而3和5 M更慢。这项工作中开发的系统完全可调与最终需求，因此可以修改最终释放曲线以获得不同结果。

2.3 植物研究

在研究PCL-U（1、3和5 M尿素）在土壤中控制和维持尿素释放的能力后，有必要测试它们在现实植物生长中的性能。

特别是，小麦草植物在盆中受控条件下生长，比较PCL-U与纯尿素在三种不同尿素浓度（1、3和5 M）。在标准肥料剂量实践中，它们对应于2.4 g尿素 kg^?1土壤（1 M）、7.2 g尿素 kg^?1土壤（3 M）和10 g尿素 kg^?1土壤（5 M）。设备放在土壤表面下5 cm，种子在土壤表面下3 cm。每盆引入50颗种子，测试进行三次。图7a显示种子发芽后2周植物的照片。可见添加PCL-U与更好性能相关，在大小和高度方面与对照组（纯尿素）相比。还可见PCL-U 3 M显示最好性能，与具有PCL-U的其他两组相比。

PCL-U设备和纯尿素对小麦草植物茎和根长影响的定量结果可见于图7b,c。使用PCL-U负责两者特性的更高长度与相应对照组相比。其中，无明显差异可见，由于类似的突释效应和尿素释放速率，如已经讨论和图6证明。图7d,e呈现发芽后2周新鲜和干燥植物的重量值。还考虑这些特性，PCL-U的效果明显，表明使用PCL-U在三种考虑的尿素浓度增强种子发芽和因此植物生长。

总之，由于三种PCL-U条件之间无大差异，PCL-U 1 M是最佳选择，因为它可以最小化尿素使用并优化其效果，降低成本。这与释放研究一致，其中PCL-U 1 M在三种考虑的情况中显示更长的线性区域和随时间维持的尿素释放。尿素的维持释放保证更少养分损失和更一致供应。植物能够吸收和利用更高比例的施用养分，导致改善的养分吸收效率，由干湿重和根长证明。增加的养分吸收转化为更健壮的植物生长和潜在更高作物产量，具有环境和经济优势。

3 结论

在这项研究中，我们研究并优化了基于聚己内酯和羟基磷灰石NPs的双连续设备，可用作尿素的控释系统。与其他可能性的主要优势在于聚己内酯是生物相容的、可生物降解的，并且已经用于作物生产，因其低成本，不同于其他复杂策略如分子有机框架。

同样的考虑可用于羟基磷灰石，农业中常用的磷源。此外，PCL-U设备的生产过程不涉及任何有机溶剂、表面活性剂或昂贵处理。其低亲水性，与涉及包覆颗粒或水凝胶的策略相比，可以更好地控制亲水分子如尿素的释放， drastically减少突释效应。

释放研究，证明它们在作物生产中的适用性，在不同介质中进行：液体（水）和固体（硅藻土和土壤）。结果显示释放速率依赖于考虑的介质，特别是固体介质能够保证尿素随时间受控和维持释放。还明显尿素通过双连续设备的传输机制也依赖于负载的尿素浓度。优化的PCL-U 1 M配方在土壤中实现超过两周的维持养分释放，改善小麦草生长与常规尿素相比，并提供减少肥料损失和环境污染的潜力。

此外，生产过程易于扩展，仅包括试剂的简单混合，连同组件的低成本，可能为作物生产中的高效和受控应用开辟道路。

4 实验部分

材料包括乙醇、ε-己内酯（CL, ≥ 99%）、1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯（TBD, ≥ 95%）、尿素（99-100.5%）、4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）、盐酸（≥ 37%）、硅藻土560、氘代水（99.9 atom% D）和阿拉伯树胶（AG），购自Sigma。氢氧化钙（≥ 98%）购自Carlo Erba Reagents。所有溶剂（分析级）和试剂未经进一步纯化步骤使用。所有反应在大气空气下进行，所有合成产品储存于4°C暗处直至使用。

羟基磷灰石NPs合成使用Kumar等人先前提出的程序的修改版本。简要地，制备氢氧化钙在蒸馏水中的溶液（0.2 M）。然后，使用注射泵，加入0.12 M H₃PO₄溶液（0.2 mL, 6 eq.）在水中（控制速率4 mL min^?1）。然后检查pH接近中性，混合物 left反应2 h。静置过夜后，溶液离心五次（5000 rpm 3 min），上清液移除，粒子再分散。获得的产品然后干燥并在烘箱中200°C煅烧6 h。总产率≈95%，羟基磷灰石收集为白色细粉末。最终产品表征并测试其纯度。为提高稳定性并避免聚集，合成的NPs使用AG溶液在适度搅拌下37°C 1 h再分散（1:1 AG:NPs比率）。如此形成的分散最终使用超声浴 sonicated 12 h使AG接枝到NPs表面。

NPs表征通过动态光散射（DLS）测量使用Malvern Zetasizer Nano ZS进行，使用173°散射角（背散射）。温度保持25°C，测量前使用60 s平衡时间。环境扫描电子显微镜（SEM）分析使用10 kV Evo 50 EP仪器（Zeiss）进行。HA NPs的尺寸和形态使用TEM分析确认，如先前工作中讨论。

PCL-U合成根据先前工作中优化的程序进行。简要地，乙醇（55 μL, 0.945 mmol, 0.2 eq.）溶于ε-CL（0.5 mL, 4.72 mmol, 1 eq.）和TBD（12.5 mg, 0.00945 mmol, 0.02 eq.）混合（1000 rpm）使用热室。多Reax Shaker带12架转盘在控制温度（16°C）6 min使用热浴。然后，0.5 mL NPs水溶液（20 mg mL^?1）与尿素（1、3或5 M）滴入反应混合物，搅拌速度增加至1500 rpm直至3D结构形成（PCL-U）。PCL-U样品可以用简单 spatula或实验室勺子处理，得益于它们的固体结构。

PCL-U设备表征通过FT-IR进行，使用Thermo Nexus 6700光谱仪配备Thermo Nicolet Continuum显微镜和15× Reflachromat Cassegrain物镜在4 cm^?1分辨率（ATR技术）。GPC分析使用凝胶渗透色谱仪（Jasco LC-2000Plus）耦合折射率检测器（RI-2031Plus, Jasco）并使用3 Agilent PLgel柱，5 μm粒径，300 × 7.5 mm（MW范围：5 × 10²至17 × 10⁵ g mol^?1）。GPC样品（PCL-U溶于四氢呋喃4 mg mL^?1浓度）用Jasco AS-2055Plus自动进样器注入。分析以四氢呋喃为洗脱剂，流速0.5 mL min^?1，温度35°C。校准用聚苯乙烯标准进行。

NMR光谱记录使用Bruker NEO500光谱仪，操作在500 MHz质子频率，配备高分辨率魔角旋转（HR-MAS）探头用于半固体样品分析。对于分析，小片样品（≈25 mg）装入ZrO₂转子，有效体积12 μL。所有HR-MAS测量记录在25°C，旋转速率4 kHz。对于每个扩散有序光谱（DOSY）实验，记录32光谱系列，16k点，D1弛豫延迟8s，扩散时间（D20）0.01 s，磁脉冲梯度（P30）3.0 ms。所有测量在每个凝胶样品上重复三次记录。

差示扫描量热法（DSC）研究使用Mettler Toledo DSC Polymer机器进行，使用小片PCL-U（≈5 mg）。仪器用锌和铟标准校准。选择加热速率10°C min^?1 under氮气流。温度变化设定 between -60和180°C使用两个加热和冷却循环。环境扫描电子显微镜分析在冻干样品上进行，使用段落2.3描述的程序。

尿素释放测试在水、惰性固体介质（硅藻土）和土壤中进行，如农业应用中常用并在先前工作中讨论。简要地，12 mL注射器填充水、硅藻土或土壤，浸没PCL-U样品。棉丝用于注射器底端避免任何硅藻土或土壤损失。注射器然后垂直固定，允许水在重力作用下移动。选择固定滴速4.17 mL h^?1，模拟灌溉时间。

然后体积烧瓶放在注射器下收集渗透水，其中包含释放的分子。在固定时间点，更换60 mL注射器以维持恒定滴注（图S1，支持信息）。然后尿素释放的量化使用UV-vis分析进行（细节在下一段落）。获得的校准可见于图S2（支持信息）。

尿素衍生化和释放量化使用DMAB作为衍生化剂。简要地，DMAB（0.1 g, 0.67 mmol, 1 eq.）溶于乙醇（5 mL, 0.087 mmol, 0.13 eq.）和HCl（0.5 mL, 6.04 mmol, 9 eq.）。溶液应在每次分析前制备并保持在暗处避免降解。对于此衍生化，需要1.5 mL尿素溶液和1 mL DMAB溶液。反应需要15 min发生，获得的混合物显示吸收峰在420 nm，不存在于未衍生化样品中。然后使用UV-vis光谱评估尿素释放量，使用V-630 UV/Vis分光光度计（校准线在图S2，支持信息）。

植物生长实验使用不同组进行，每组三个盆作为重复。50颗小麦草种子引入每盆，土壤表面下3 cm（图S3，支持信息）。选择用于此实验的土壤是表土，用于植物栽培。研究的组对应于：a) 土壤添加PCL-U 1 M（1.2 g尿素负载）、PCL-U 3 M（3.6 g尿素负载）和PCL-U 5 M（6 g尿素负载），b) 土壤处理用粉末尿素1 M（1.2 g尿素）、3 M（3.6 g尿素）和5 M（6 g尿素）。在标准肥料剂量实践中，它们对应于2.4 g尿素 kg^?1土壤（1 M）、7.2 g尿素 kg^?1土壤（3 M）和10 g尿素 kg^?1土壤（5 M）。盆 contained在温室中 under直接日光，保持温度25°C。

两周后，取出小麦草植物，从每组三个盆中随机选择20株植物。然后测量并记录根和茎的长度及其鲜重和干重。

统计分析使用Prism软件（Graphpad）进行。为测试差异，使用方差分析和非参数t检验。事后检验用于识别特定组差异。p值<0.01被认为对所有分析显著。结果呈现为平均值±标准偏差。