揭示两种根瘤菌株对三种大豆品种植物化学物分泌、抗氧化活性及营养品质的生物肥料潜力

本研究揭示了Rhizobium sp. S1和S2菌株接种对三种大豆品种（Glycine max L.）植物化学物（如多酚、黄酮、生物碱等）分泌、抗氧化活性（FRAP和TAC）及种子营养品质（蛋白质、纤维、糖等）的显著提升作用，为可持续农业中生物肥料（biofertilizers）的应用提供了重要理论依据和实践价值。

　　

1. 引言

根瘤菌（Rhizobia）作为化学肥料的可持续替代品，因其与豆科植物共生固氮的能力而备受关注。尽管化学肥料在过去几十年中因增产效果显著而主导农业实践，但其过度使用引发了农产品质量和环境污染的担忧。联合国可持续发展目标提倡可持续农业实践和粮食安全，全球趋势正转向绿色和可持续农业。根瘤菌通过促进氮固定和提高作物生产率，成为应对这些挑战的有前途方案。研究表明，接种根瘤菌可改变豆类植物中生物活性化合物的 profile，增加黄酮、多酚、有机酸和挥发性化合物的水平，同时增强抗氧化活性。这些次生代谢物不仅改善收获种子的功能性，还具有健康益处。然而，接种对豆类生产力和功能特性的有益效果取决于根瘤菌菌株，因此需要更特异和适应的菌株。

在非洲，尽管根瘤菌应用潜力巨大，但该大陆在欧洲和北美之后。针对大豆的具体研究在非洲有限，特别是在喀麦隆，研究主要集中在根瘤菌的固氮潜力，而未评估其对植物化学物分泌和抗氧化剂的影响。大豆是非洲产量最高的豆类之一，富含蛋白质和植物化学物，如异黄酮，具有抗氧化、抗菌和激素特性，可降低心血管疾病和某些癌症的风险。本研究旨在评估两种先前从大豆根瘤中分离的根瘤菌菌株（Rhizobium sp. S1和S2）对喀麦隆种植的三个大豆品种的生物肥料潜力，重点关注其对植物化学物分泌、抗氧化活性和收获种子营养品质的影响。

2. 材料与方法

2.1. 试验点的气候和土壤特征

研究于2022年3月至8月在喀麦隆中部地区的Mbalmayo试验站进行，该站位于湿润森林地带，属热带气候，双峰降雨。土壤为铁铝质、酸性、粘土质，养分保持能力低，影响当地耕作实践。土壤pH为6.01，CEC为14.48 cmol(+)/kg，质地分析显示沙占50.89%，粘土占33.47%，粉砂占15.64%。矿物质包括钙（269.90 ppm）、镁（113.23 ppm）、钾（31.66 ppm）、铜（2.56 ppm）、总磷（4.48 ppm）、锌（2.10 ppm）和可吸收磷（Bray P，0.74 ppm）。铁和锰水平分别为98.78和156.32 ppm，可交换酸度和铝水平未检测到。土壤氮含量为0.09%，有机碳含量为0.97%，C/N比为10.89。

2.2. 大豆品种

选择了三种在非洲广泛种植的大豆品种：TGX 1910 14F（贝宁）、Maksoy 4N（乌干达）和TGX 1835 10E（尼日利亚）。这些品种因其产量、应激耐受性和对当地气候条件的适应性而被保留。

2.3. 根瘤菌培养和接种物制备

使用的两种菌株（Rhizobium sp. S1和S2）由喀麦隆雅温得药用植物研究中心食品研究与质量控制实验室提供。这些从大豆根瘤中分离的菌株因在环境应激条件下生长的能力而被选择。从冷冻库存中，分离物在酵母提取物甘露醇 broth（YEM）中于28°C培养72小时，年轻细胞涂布在酵母提取物甘露醇琼脂上，负载调整至9 log CFU/mL。

2.4. 大豆种子接种

种子在1 L接种液（9 log CFU/mL）中浸泡5分钟，确保细菌 optimal 粘附。处理后，涂层种子在阴凉处干燥后播种。

2.5. 研究地块设置

试验地准备未施肥，使用手动除草和简陋工具。500 m2地块采用精细耕作，三种大豆品种以完全随机区组设计播种，两种接种处理（Rhizobium sp. S1和S2）和未接种对照（T0）。每个处理重复三次。种子播种在3 m长的行中，品种间间距1 m，同行间距0.5 m。为限制杂草生长，每2周手动除草一次。出苗后10天，植物间苗以促进发育。播种后灌溉，之后每3天无雨时灌溉。120天后手工收获地块，当植物达到生理成熟时。

2.6. 土壤采样

使用对角线方法在试验地采样。土壤样品在0-20 cm深度采集，使用 auger 沿每条对角线垂直插入。每个象限采集的样品合并为复合样品，运输到实验室分析。复合样品在35±1°C的Binder烘箱中风干24小时至恒重。干燥后，样品用研钵研磨，通过2 mm筛去除植物或草片段。评估了样品的质地、pH、总氮、有机碳、阳离子交换容量（CEC）、可用磷、可交换铝、可交换酸度、基本阳离子（Ca、Mg、Na、K）和微量元素（Zn、Cu、Mn、Fe）。

2.7. 田间样品收集

在结瘤和荚果形成阶段，随机采样每个大豆品种的三株植物（接种和未接种），50°C干燥24小时，粉碎以评估生物活性化合物生产、抗氧化活性和总氮含量。

2.8. 生物活性化合物评估

2.8.1. 提取物制备

使用水乙醇溶剂制备提取物，方法如Kakar等所述。50克植物粉末溶解在500 mL水乙醇（水:乙醇，20:80, v/v）中，混合物均质后在室温（25±2°C）黑暗下 agitation 12小时，通过Whatman纸（No. 2）过滤，滤液在50°C通风烘箱中脱水72小时，称重，储存在黑暗密闭瓶中供未来分析。

2.8.2. 总多酚

使用Folin–Ciocalteu法估计总多酚，方法如Singleton和Rossi所述。约0.1 mL各提取物（2 mg/mL）与0.75 mL Folin–Ciocalteu溶液混合，室温孵育5分钟，然后加入0.75 mL碳酸钠溶液（Na₂CO₃, 6%），均质后黑暗孵育90分钟，在725 nm读取吸光度 against 空白。没食子酸（0–1000 μg/mL）用作标准，总多酚含量从校准曲线（r²=0.97）获得，以微克没食子酸 equivalent 每克干 matter（μg GAE/g DM）表示。

2.8.3. 总黄酮

使用Aiyegoro和Okoh的比色法测定总黄酮含量。约0.5 mL各提取物（2 mg/mL）加入1.5 mL甲醇，然后加入0.1 mL氯化铝（AlCl₃, 10%）、0.1 mL乙酸钾（CH₃COOK, 1 M）和2.8 mL蒸馏水，混合物均质后室温孵育30分钟，在415 nm读取吸光度 against 试剂空白。槲皮素（0–1000 μg/mL）用作标准，总黄酮含量从校准曲线（r²=0.99）获得，以微克槲皮素 equivalent 每克干 matter（μg QE/g DM）表示。

2.8.4. 总单宁

使用Bainbridge等的方法测定总单宁含量。约1 mL各提取物（2 mg/mL）与5 mL工作溶液[50 g香草醛+4 mL HCl（1 N）在100 mL蒸馏水中]混合，30°C孵育20小时，在500 nm读取吸光度 against 空白。单宁酸（0–1000 μg/mL）用作标准绘制校准曲线（r²=0.98），结果以微克单宁酸 equivalent 每克干 matter（μg TAE/g DM）表示。

2.8.5. 总生物碱

使用Singh等的略修改版方法量化总生物碱。约100 mg各提取物溶解在10 mL 80% (v/v) 乙醇-水溶液中，混合物均质后以5000 rpm离心10分钟，取1 mL上清液加入试管，分别加入1 mL acidified FeCl₃ (0.025 M) (0.5 M HCl) 和1 mL乙醇性1,10- phenanthroline (0.05 M)，混合物在100°C水浴中孵育30分钟，读取形成的 reddish complex 在510 nm的吸光度 against 空白。奎宁（25 μg/mL）用作标准，总生物碱含量以微克奎宁 equivalent 每克干 matter（μg QuiE/g DM）表示。

2.8.6. 总皂苷

根据Hiai等的方法测定总皂苷含量。200 μL各提取物加入试管，随后加入200 mL乙醇性香草醛溶液（在80%乙醇中制备）和2000 μL硫酸（72%），混合物均质后60°C水浴10分钟，读取 prepared 溶液在535 nm的吸光度 against 空白。皂苷标准在不同浓度（0–1000 μg/mL）下使用以建立校准范围（R²=0.95），结果以微克皂苷 equivalent 每克样品干 matter（μg SaE/g DM）表示。

2.9. 植物提取物抗氧化活性评估

使用三种方法评估抗氧化活性，包括铁离子还原能力（FRAP）和总抗氧化 capacity（TAC）。

2.9.1. TAC评估

使用Prieto等的磷钼法评估TAC。简要地，0.2 mL各提取物在4个不同浓度（0.5, 1.0, 1.5, 和2.0 mg/mL）与2 mL工作试剂溶液（0.6 M H₂SO₄ 98%, 28 mM NaH₂PO₄, 和4 mM ammonium molybdate）混合，试管 screw-capped 后在95°C孵育90分钟，冷却后读取溶液在765 nm的吸光度 against 空白试剂（2 mL试剂溶液+0.2 mL蒸馏水）。抗坏血酸（10–100 μg/mL）用作标准，TAC以微克抗坏血酸 equivalent 每克干 matter（μg AAE/g DM）表示。

2.9.2. FRAP评估

根据Oyaizu等的方法测定提取物的铁还原抗氧化 power。在协议中，1 mL各提取物在不同浓度（0.5, 1.0, 1.5, 和2.0 mg/mL）与2.5 mL 0.2 M磷酸盐 buffer（pH 6.6）和2.5 mL 1% (w/v) 铁氰化钾溶液（K₃[Fe(CN)₆]）混合，混合物50°C水浴孵育20分钟，然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液停止反应，试管以3000 rpm离心10分钟，取2.5 mL上清液与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁（FeCl₃）水溶液结合，读取反应介质在700 nm的吸光度 against 空白（用蒸馏水代替提取物制备）。抗坏血酸（10–100 μg/mL）用作标准，铁还原能力以微克抗坏血酸 equivalent 每克干 matter（μg AAE/g DM）表示。

2.10. 茎总氮含量

使用Kjeldahl法量化在结瘤和荚果形成期间采集的茎的总氮含量。

2.11. 收获大豆种子的营养组成

生长周期结束（第120天）时，收获荚果并脱粒以提取每株植物的种子。种子洗涤，用蒸馏水冲洗，65°C强制通风烘箱中干燥24小时至恒重，干燥样品使用实验室研磨机（Moulinex, France）研磨至1 mm粒径，粉末转移到干净玻璃瓶中，密封，室温（25°C）黑暗储存供分析。对种子进行的营养分析涉及干 matter、灰分、蛋白质、脂质、总糖和膳食纤维。

2.12. 统计分析

田间实验使用完全随机区组设计重复三次。所有生物数据测量至少重复三次，获得的数据以均值±标准差呈现。这些均值用于统计分析。数据 subjected to 方差分析（ANOVA），均值比较使用Duncan's multiple-range test 以最大化统计 power 和 test 的 robustness 并管理 type II error 风险。显著性水平设为5%。使用的软件是Statgraphics Centurion XV Version 16.1.18。Pearson相关用于评估大豆品种、植物中生物活性化合物含量、植物抗氧化活性、接种处理和收获种子营养组成之间的关系。这些参数之间的关联使用主成分分析（PCA）通过XLSTAT软件Version 2014.5.03评估。使用一般线性模型（GLM）进行双向ANOVA以检测生物活性化合物、总氮含量和收获种子营养组成之间的统计差异，分析使用Minitab 18.1.0进行。

3. 结果

3.1. 试验点土壤特性

Mbalmayo试验站土壤pH为6.01，CEC为14.48 cmol(+)/kg，质地组成50.89%沙、33.47%粘土、15.64%粉砂，干 matter 和水分含量分别为98.61%和1.39%。矿物质包括钙（269.90 ppm）、镁（113.23 ppm）、钾（31.66 ppm）、铜（2.56 ppm）、总磷（4.48 ppm）、锌（2.10 ppm）和可吸收磷（Bray P，0.74 ppm）。铁和锰水平分别为98.78和156.32 ppm，可交换酸度和铝水平未检测到。土壤氮含量0.09%，有机碳含量0.97%，C/N比10.89。

3.2. 大豆样品总氮含量

播种后60天记录茎总氮含量，不论大豆品种和接种。对于不同大豆品种，接种Rhizobium sp. S2导致大豆品种TGX 1910 14F的最高总氮含量（3.34%）。类似地，接种Rhizobium sp. S1显著改善（p<0.05）同一品种的总氮含量，值为2.93%，对照为2.53%。另一方面，对于Maksoy 4N和TGX 1835 10E品种，最高总氮含量记录在未接种对照植物中。

3.3. 接种对三种大豆品种植物提取物生物活性化合物分泌的影响

接种Rhizobium sp. S1和S2的植物生物活性化合物含量 presented in Table 1。通常，接种根瘤菌菌株显著改善了不同大豆品种的生物活性化合物含量。对于TGX 1910 14F，接种Rhizobium sp. S1获得总多酚值332.0±8.23 μg GAE/g DM，而接种Rhizobium sp. S2为372.23±12.96 μg GAE/g DM。接种Rhizobium sp. S1和S2获得的总黄酮含量无显著差异（70.47±5.61 vs. 76.62±5.02 μg QE/g DM）。接种Rhizobium sp. S1和S2记录总生物碱含量分别为142.77±0.50和147.28±2.96 μg QuiE/g DM。植物单宁和皂苷分泌也因种子接种而增强。通常，处理样品中的生物活性化合物显著高于对照。显著改善在生长60天后更明显。

关于Maksoy 4N品种，接种Rhizobium sp. S1在改善总多酚（408.66±12.48 GAE/g DM）方面比Rhizobium sp. S2（170.09±10.16 GAE/g DM）和对照（104.61±3.52 GAE/g DM）更高效。然而，接种Rhizobium sp. S2和对照的植物总多酚含量从第15天到第60天下降。类似趋势 observed for 总黄酮和总生物碱。最高皂苷含量记录 with 种子接种Rhizobium sp. S2（4116.67±17.55 μg SaE/g DM）。然而，尽管不显著，接种Rhizobium sp. S2的植物皂苷含量随时间从2826.67±72.85降至2646.67±7.63 μg SaE/g DM。植物单宁含量随时间增加，尽管种子接种导致更明显和显著的增强。最高单宁含量观察 with 种子接种Rhizobium sp. S2（1.61±0.59 μg TAE/g DM）。关于TGX 1835 10E，尽管总多酚含量随时间下降，但注意到与对照相比的显著改善。

菌株Rhizobium sp. S2（378.42±10.30 GAE/g DM）比Rhizobium sp. S1（329.85±14.33 GAE/g DM）更高效。类似行为 observed with 总生物碱和单宁。对于黄酮，处理 with Rhizobium sp. S2显示最高含量（65.06±4.96 μg QE/g DM），而处理 with Rhizobium sp. S1和对照之间无显著差异。植物皂苷含量在生长期显著增加，独立于大豆品种和处理。最高含量记录 with 种子接种Rhizobium sp. S2（3835.50±45.00 μg SaE/g DM），尽管与处理 with Rhizobium sp. S2（3793.83±49.53 μg SaE/g DM）和对照（3754.17±86.47 μg SaE/g DM）相比不显著。

3.4. 种子接种根瘤菌菌株对植物抗氧化活性的影响

使用两种方法评估接种大豆种子提取物的抗氧化活性，包括FRAP和TAC。鉴于生物活性化合物是植物作为对生长周期中发生的应激和环境变化的响应而分泌的，抗氧化活性在结瘤和荚果形成期间评估。

FRAP结果显示提取物的铁还原能力浓度依赖性增加，独立于大豆品种和接种处理。对于TGX 1910 14F，接种效果与对照相比当提取物浓度大于或等于1 mg/mL时变得显著。该差异在来自第60天采集植物的提取物中更明显，特别是在2 mg/mL浓度。Figure 2b显示来自种子接种Rhizobium sp. S2的植物提取物 exhibited 最高铁还原能力（178.84±4.35 μg AAE/mg DM） compared to 那些来自种子接种Rhizobium sp. S1（144.03±2.44 μg AAE/mg DM）和对照（101.34±4.07 μg AAE/mg DM）。类似趋势记录 with 来自Maksoy 4N和TGX 1835 10E的植物提取物在第15天。然而，在第60天，与Maksoy 4N品种观察到相反情况，因为最高铁还原能力值 noticed with 种子接种Rhizobium sp. S1的植物提取物独立于测试浓度。在第60天，提取物来自种子接种Rhizobium sp. S1和对照的铁还原能力之间无显著差异（p>0.05），独立于浓度。对于TGX 1835 10E在第60天，对照的植物提取物在0.5, 1.0, 和1.5 mg/mL浓度比接种种子更活跃。仅在2 mg/mL时，来自种子接种Rhizobium sp. S2的提取物 present 一种活性（169.03±32.36 μg AAE/mg DM）高于对照（98.84±95.73 μg AAE/mg DM）。然而，来自种子接种Rhizobium sp. S1的提取物保持 less active（65.0±3.26 μg AAE/mg DM）比对照。

TAC结果也显示提取物的剂量依赖性活性，独立于大豆品种和接种处理。对于所有提取物，TAC在第60天相比第15天显著（p<0.05）更重要。接种对品种TGX 1910 14F提取物TAC的影响在本研究测试的不同浓度下可变。如Figure 3a所示，在1.0 mg/mL，来自种子接种Rhizobium sp. S2的植物提取物更活跃（70.93±13.19 μg AAE/mg DM），而在2 mg/mL，它是那些来自种子接种Rhizobium sp. S1（379.26±2.35 μg AAE/mg DM）。然而，在Figure 3b，来自种子接种Rhizobium sp. S2的植物提取物在1.0和2.0 mg/mL保持最活跃。值得注意的是，对于第15和60天，TAC在1.5 mg/mL浓度下降。对于Maksoy 4N，在0.5和1.5 mg/mL获得的TAC值更高 with 植物提取物来自种子接种Rhizobium sp. S2，而在1和2 mg/mL，它们 with 种子接种Rhizobium sp. S1。对于TGX 1835 10E，尽管显示抗氧化活性，但来自种子接种Rhizobium sp. S1或S2的植物提取物的TAC值低于对照。接种处理与该大豆品种无效。

3.5. 种子接种对三种大豆品种收获种子营养组成的影响

文化期后，收获种子并提交分析以评估接种Rhizobium sp. S1和S2对其营养组成的影响。Table 2显示种子干 matter 随大豆品种和接种处理显著变化。通常，干 matter 值 around 10 g/100 g DM。种子蛋白质含量为35.24±0.03 g/100 g DM for TGX 1910 14F, 35.12±0.03 g/100 g DM for Maksoy 4N, 和37.43±0.03 g/100 g DM for TGX 1835 10E。对于TGX 1910 14F，接种Rhizobium sp. S1和S2略微改善了蛋白质含量，尽管与对照相比不显著（p>0.05）。显著（p<0.05）增强蛋白质含量从35.12±0.03至39.51±0.19 g/100 g DM记录 with 种子来自Maksoy 4N接种Rhizobium sp. S2。然而，对于TGX 1835 10E，接种Rhizobium sp. S1显著（p<0.05）降低了蛋白质含量，而 with Rhizobium sp. S2，蛋白质含量与对照无显著差异（p>0.05）。

与对照相比，来自TGX 1835 10E的种子脂质含量在接种Rhizobium sp. S1和S2后显著（p<0.05）减少。相同观察 made with 品种Maksoy 4N，尽管脂质减少在接种Rhizobium sp. S1后不如TGX 1835 10E明显。然而，与TGX 1910 14F观察到相反情况，因为种子脂质含量显著（p<0.05）改善 compared to 对照。

膳食纤维也受种子接种两种根瘤菌菌株影响。对TGX 1910 14F影响负面，因为膳食纤维含量在接种后显著减少。对于Maksoy 4N，接种Rhizobium sp. S1后种子膳食纤维增加 observed compared to 对照（6.93±0.06 vs. 6.60±0.10 g/100 g DM），而减少记录 with 种子接种Rhizobium sp. S2（5.42±0.07 g/100 g DM）。接种TGX 1835 10E种子导致膳食纤维含量显著改善。效果在接种Rhizobium sp. S1后更重要（8.83±0.08 g/100 g DM） compared to Rhizobium sp. S2（8.27±0.05 g/100 g DM）。

种子总糖在接种Rhizobium sp. S1或S2后改善，尽管不总是显著（p>0.05）。最高总糖（9.04±0.28 g/100 g DM）记录 with 种子来自Maksoy 4N接种Rhizobium sp. S2。与其他参数相反，种子灰分含量作为接种两种根瘤菌菌株的结果显著减少。对于TGX 1910 14F和TGX 1835 10E，尽管不显著，最高灰分减少记录 with 种子接种Rhizobium sp. S1（3.33±0.04和2.96±0.06 g/100 g DM）。然而，对于Maksoy 4N最高灰分减少 noticed with 种子接种Rhizobium sp. S2（2.56±0.53 g/100 g DM）。

总碳水化合物含量随品种和根瘤菌接种处理显著变化。对于TGX 1910 14F品种，接种（S1, S2）未导致与对照的显著差异。相反，接种显著降低Maksoy 4N的碳水化合物含量。反之，TGX 1835 10E在接种后 exhibited 总碳水化合物显著增加。这些发现突出品种特异性响应接种，表明根瘤菌对碳水化合物组成的影响取决于基因型-微生物相互作用。

3.6. PCA

Figure 4显示植物化学物、总氮含量和大豆品种在F1×F2轴系统上的分布。如Figure 4所示，基于植物化学物、总氮含量和所有大豆品种之间的关系形成四组。第一组包含Maksoy 4N T0、TGX 1910 14F T0和单宁。第二组，与第一组相反，包含总氮含量、接种S1的TGX 1910 14F和接种S2的TGX 1910 14F。该观察表明接种Rhizobium sp. S1和S2菌株对TGX 1910 14F显著改善了其总氮含量。第三组由多酚、黄酮、生物碱、接种S1的Maksoy 4N和未接种的TGX 1835 10E组成。该观察表明来自接种Rhizobium sp. S1的Maksoy 4N种子刺激植物分泌这3种植物化学物。第四组包含皂苷、接种S2的Maksoy 4N、接种S1的TGX 1835 10E和接种S2的TGX 1835 10E。这表明接种Rhizobium sp. S1和S2菌株对TGX 1835 10E和接种Rhizobium sp. S2对Maksoy 4N与皂苷分泌正相关