中-俄-朝边境地区蜱类RNA病毒多样性及公共卫生风险研究

本文通过宏转录组学分析揭示了中俄朝边境地区五种蜱类携带的22种病毒，包括5种已知人类病原体和9种潜在人畜共患病毒，阐明了病毒群落组成与生态地理因素的关联，为边境地区生物安全和新兴传染病防控提供了重要科学依据。

　　

1. 引言

蜱是仅次于蚊子的第二大自然虫媒病毒传播载体，全球已发现800多种蜱类，能够传播超过200种病原体，其中包括160多种蜱媒病毒，对公共卫生构成重大威胁。约30%的蜱媒病毒与严重人类疾病相关，例如薛城病毒（XCV）、松岭病毒（SGLV）、北疆纳伊罗病毒（BJNV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、湿地病毒（WELV）、克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和敖东杉病毒（ALSV）等。近年来，随着对蜱媒病原体研究的深入，大量新型病原体被发现，蜱媒疾病发病率呈上升趋势，这表明存在大量未被发现、潜在致病的蜱媒病原体库。

下一代测序（NGS）技术已广泛应用于人类、动物和植物病原体监测。宏转录组学分析作为一种关键工具，能够动态监测已知和新发病原体，阐明病毒进化模式，并为传播机制和公共卫生风险评估提供关键见解。

中-俄-朝边境地区生物多样性丰富，跨境贸易活动频繁，对气候变化高度敏感，其年气温上升速率超过全国平均水平。这种气候变化延长了蜱的活动期，显著增加了新发传染病的风险。迄今为止，已在该地区发现多种人畜共患病毒。这些发现凸显了在这一生态脆弱区加强蜱媒疾病监测的必要性。本研究旨在通过宏转录组学分析，阐明该地区蜱类物种分布及其相关病毒流行情况，为评估跨境传播风险和制定针对性生物安全措施提供关键数据。

2. 材料与方法

2.1. 样本采集与鉴定

于2023年和2024年4月至7月期间，使用绒布拖旗法在中-俄-朝边境地区的四个区域（安图县、珲春市、和龙市和龙井市）采集蜱类样本。采集的标本在运输过程中于干冰上暂时保存，随后转入实验室-80°C超低温冰箱长期保存。通过体视显微镜形态学初步鉴定后，利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因测序进行分子确认。

2.2. RNA文库构建与测序

将收集的蜱标本根据采集地点、物种和性别分为287个池。样本依次在75%乙醇中浸泡，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.4）清洗三次进行去污。每个池在含有两颗3毫米锆珠的500 μL DMEM培养基中，使用高通量组织研磨器均质。匀浆离心后，上清液依次通过0.45 μm和0.22 μm滤膜过滤去除残留颗粒。将287个滤液样本根据采样地点分为四个文库进行总RNA提取和测序。宏转录组分析由上海个人生物科技有限公司利用Illumina NovaSeq 6000平台完成。

2.3. 生物信息学分析

使用fastp对原始测序数据进行质控，去除低质量序列。使用minimap2将清洁读数比对到宿主基因组以去除宿主污染。使用MEGAHIT对剩余的高质量读数进行从头组装。使用Kaiju和DIAMOND BLASTp对重叠群进行 taxonomic 注释。

2.4. 病毒筛查

设计引物通过RT-PCR验证Illumina测序结果，阳性扩增产物进行Sanger测序验证。

2.5. 系统发育分析

使用MAFFT进行多序列比对，使用IQ-TREE构建最大似然系统发育树。

2.6. 统计分析

使用PooledInfRate软件计算蜱的病毒感染率，病毒流行率以每100只蜱的最大似然估计值（MLE）及95%置信区间（95% CI）表示。

3. 结果

3.1. 蜱类采集与鉴定

共从中-俄-朝边境地区采集1962只蜱，鉴定为5个物种：长角血蜱（493只）、嗜群血蜱（733只）、日本血蜱（151只）、全沟硬蜱（161只）和森林革蜱（424只）。采样点包括和龙市（416只）、珲春市（676只）、安图县（578只）和龙井市（292只）。分析显示，嗜群血蜱、日本血蜱和全沟硬蜱在所有四个采样点均有分布，而长角血蜱仅在珲春市检测到。

3.2. RNA病毒的检测与统计分析

构建并测序了四个RNA病毒组文库，产生90 GB原始数据。质控后获得1,727,344条清洁读数。从头组装获得4526个病毒重叠群。病毒序列被注释为9个病毒科和1个未分类科，涵盖22个病毒物种。鉴定出5个具有潜在人畜共患风险的RNA病毒科：黄病毒科（Flaviviridae）、纳伊罗病毒科（Nairoviridae）、白纤维病毒科（Phenuiviridae）、楚病毒科（Chuviridae）和弹状病毒科（Rhabdoviridae）。病毒读长丰度分析显示，纳伊罗病毒科中的正纳伊罗病毒属（Orthonairovirus）丰度最高，主要以SGLV为代表。读长丰度第二高的是YGTV。通过PCR验证了上述病毒，并分析了其地理和蜱种分布模式。

病毒物种和流行率在四个采样区域表现出显著的地理异质性和蜱种特异性。珲春检测到的病毒多样性最高（14种），而和龙最低（仅3种）。值得注意的是，只有SGLV和莱斯诺埃米病毒（LMV）在所有四个区域都被检测到。在安图发现了种类最多的潜在人类感染病毒。和龙和龙井各发现一种人类相关病毒。几种病毒表现出明显的地理限制性。

在蜱种水平分析显示，全沟硬蜱携带的病毒多样性最高（8种病毒）。在所有病毒中，LMV在和龙的日本血蜱中流行率最高，而MLV和THRV1在安图的森林革蜱中流行率最低。

3.3. RNA病毒多样性与进化

对鉴定出的病毒进行了详细的系统发育分析，包括白纤维病毒科（如DBTV、MKWV、STPV）、纳伊罗病毒科（如SGLV、BJNV、HCNV、JANV、XCV）、黄病毒科（YGTV）、楚病毒科（LMV）、弹状病毒科（THRV1、YBRV4、YBRV1、MLV）、双分病毒科（JLPV1）、番茄丛矮病毒科（CLTV3、NXLV）、马铃薯Y病毒科（XTAV1、HSLV15、ISAV1）和戊肝病毒科（Hepelivirales sp.）的成员，明确了它们的分类地位和与已知病毒的亲缘关系。

4. 讨论

本研究首次全面描述了中-俄-朝边境地区蜱类携带的病毒组成，发现了22种病毒，分属10个病毒科，其中5种为已知人类病原体，9种具有潜在人畜共患风险。研究结果与既往报道相互印证，并揭示了病毒分布的地理异质性和蜱种特异性。病毒流行率的空间差异可能由动物迁徙、气候变异、人类活动和栖息地改变等多因素驱动。本研究也存在一些局限性，如未检测到该地区既往报道的某些病毒，可能与采样时空范围、病毒活动周期以及病毒变异等因素有关。未来需要扩大宏转录组学分析的地理范围，优化跨季节采样策略，并系统收集环境参数和人类活动数据，以更深入地探索病毒传播模式和进化轨迹。

5. 结论

本研究通过对中-俄-朝边境地区蜱媒病毒的宏转录组学分析和流行率调查，首次系统评估了该地区的蜱媒病毒组，揭示了其潜在的公共卫生风险。这些发现不仅增强了我们预测这些病毒时空分布和传播动态的能力，也为跨境联防联控策略以及新发传染病的风险评估和早期预警奠定了关键的数据基础。