钙信号传导新机制：MfCML50与MfCDH互作通过香芹酮合成及ROS稳态调控紫花苜蓿抗冷性

本文揭示了植物响应低温过程中钙信号（Ca2+）通过钙调素类似蛋白MfCML50与短链脱氢酶MfCDH的互作，激活香芹酮生物合成通路，进而调控活性氧（ROS）稳态以增强抗冷性的新机制。该研究为作物抗逆遗传改良提供了关键靶点与理论依据。

　　

分子特性与表达模式分析

MfCML50编码167个氨基酸的蛋白质，分子量为18.2 kDa，系统进化分析显示其与蒺藜苜蓿MtCML50的氨基酸序列一致性达95.8%。该蛋白定位于细胞质和细胞核，在黄花苜蓿的花器官中表达量最高。低温处理2小时后，MfCML50转录水平显著诱导，24小时达到峰值。MfCDH作为其互作蛋白，同样在花中高表达，且低温处理12小时后表达量最高。

MfCML50正调控抗冷性

过表达MfCML50的蒺藜苜蓿株系在非驯化（NA）和冷驯化（CA）条件下均表现出更低的半致死温度（TEL₅₀）和更高的存活率。相反，MtCML50敲除突变体（cml50-1和cml50-2）则表现出冷敏感性。回补实验证实MfCML50可完全恢复突变体的抗冷缺陷，表明MfCML50在低温应答中起正向调控作用。

Ca²⁺依赖的MfCML50-MfCDH互作机制

酵母双杂交、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等实验证实MfCML50与MfCDH直接互作。微量热泳动（MST）分析显示，Ca²⁺可显著增强两者结合亲和力，结合常数（K_d）从1.703 μM降至0.057 μM（351 nM Ca²⁺条件下），表明该互作严格依赖Ca²⁺信号。

MfCDH酶学特性与功能验证

MfCDH催化香芹醇转化为香芹酮，米氏常数（K_m）为10.25 μM，最适pH为7.5。过表达MfCDH显著增强植株抗冷性，而其突变体（cdh）则表现冷敏感表型。外源施加香芹酮可挽救cml50和cdh突变体的抗冷缺陷，证实MfCDH通过香芹酮合成途径调控抗冷性。

香芹酮的抗氧化活性与ROS稳态调控

DPPH自由基清除实验显示，香芹酮具有较强的抗氧化能力，其等效维生素C抗氧化活性（EVCAA）远高于香芹醇。低温条件下，MfCML50和MfCDH过表达株系中H₂O₂和O₂^•?积累显著减少，而突变体中ROS大量累积。这表明MfCML50-MfCDH模块通过促进香芹酮合成，直接参与ROS清除，维持氧化稳态。

Ca²⁺信号的核心作用

EGTA（Ca²⁺螯合剂）处理可消除MfCML50和MfCDH过表达株系的抗冷优势，证明Ca²⁺信号是该调控模块的上游激活因子。低温诱导的胞内Ca²⁺浓度升高通过激活MfCML50，进而增强MfCDH酶活，驱动香芹酮合成以应对氧化胁迫。

生物学意义与应用前景

该研究首次揭示了Ca²⁺/CML信号通过直接调控次级代谢酶（SDR家族成员）参与抗冷应答的机制，拓宽了植物钙信号转导通路的功能范畴。香芹酮作为一种新型非酶抗氧化剂，在作物抗逆遗传改良中具有潜在应用价值。MfCML50-MfCDH模块为分子设计育种提供了关键靶点。