综述：通过宿主DNA去除技术推进植物微生物组研究

这篇综述系统梳理了植物微生物组研究中宿主DNA污染问题的解决方案，重点介绍了物理分离、选择性裂解、酶学处理等传统方法，以及CRISPR-Cas9、纳米孔选择性测序等新兴技术。文章指出优化宿主DNA去除策略对实现高分辨率宏基因组分析至关重要，将为作物改良和可持续农业提供技术支撑。

　　

植物微生物组研究的重要性

植物为多种微生物提供了生态栖息地，包括细菌、古菌、真菌、病毒和原生生物等，它们栖息在根际、内生圈和叶际等不同生态位点。这些植物相关微生物组与宿主形成复杂的互作网络，贡献于养分获取、生长促进、胁迫耐受和病原防御。微生物伙伴是植物功能和环境适应的关键贡献者，形成一个共同依赖的系统，整体响应生物和非生物刺激。

植物与微生物的互作涵盖广泛的生态关系，包括互利共生、偏利共生和致病性。有益微生物如植物根际促生细菌（PGPR）和丛枝菌根真菌通过增强养分吸收、产生植物激素和抑制病原体来促进植物健康。相比之下，病原微生物可通过组织入侵、资源竞争和释放植物毒素破坏植物健康。

宿主DNA污染的挑战

尽管宏基因组学革命性地改变了植物微生物组研究，使其能够超越传统培养方法，但宿主来源DNA的污染仍然是主要技术障碍。植物基因组显著大于微生物基因组（例如油菜基因组约1.1 Gb，而平均细菌基因组约3.6 Mb）。即使少量植物来源材料也会淹没微生物DNA池，导致微生物基因组测序覆盖不足，阻碍微生物多样性和功能基因的准确检测。

宿主DNA污染会导致测序资源浪费、检测灵敏度降低以及微生物群落重建偏差。虽然增加测序深度可以部分解决这个问题，但成本高昂且计算需求大，特别对于大规模研究。因此，克服宿主DNA污染对于富集微生物含量、优化测序效率和获得高质量微生物基因组数据至关重要。

宿主DNA去除方法的进展

微生物富集方法

通过利用微生物和真核宿主细胞在大小和密度上的差异，过滤、差速离心和密度梯度离心等技术常用于分离宿主细胞和微生物细胞。密度梯度离心成功富集了甜菜内生微生物，通过质量过滤和宿主DNA去除后实现约24.6%的非宿主DNA含量。然而，梯度离心虽然能有效减少宿主污染并富集微生物，但也会降低总体微生物含量，并可能导致某些微生物群体的偏向性富集。

选择性裂解提供了另一条途径，利用宿主和微生物细胞的不同脆弱性。哺乳动物细胞缺乏细胞壁，容易被温和去污剂（如皂苷、Triton X-100、Tween 20）裂解，但植物细胞由于由纤维素、半纤维素和果胶组成的刚性细胞壁而面临重大挑战。皂苷已显示出在不破坏细菌细胞的情况下选择性裂解哺乳动物宿主细胞的前景。

酶解法通过使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等水解酶选择性降解植物细胞壁，同时保持微生物细胞完整。然而，植物细胞壁的结构和组成在不同物种和组织间差异很大，需要定制优化酶浓度和孵育条件，限制了通用方案的开发。

机械裂解方法（如珠磨）通过基于大小差异选择性破坏较大的宿主细胞提供了替代方案。通过调整珠子大小、震荡速度和持续时间，可以优先裂解宿主细胞，同时保持微生物完整性。使用较大的研磨珠（1.4 mm）选择性破坏宿主细胞，然后使用适当的DNase降解释放的宿主DNA，可有效降低宿主DNA污染1000倍以上，实现高质量细菌MAGs的组装。

DNA提取后的宿主DNA去除

宿主和微生物DNA之间的显著序列差异可用于选择性富集微生物DNA。高度多重化的序列捕获技术通过选择性扩增其序列，能够靶向富集成百上千种已知病毒和细菌的DNA。这些探针可以固定在固体载体上或进行生物素化，用于与目标DNA进行序列特异性杂交。

DNA甲基化作为关键表观遗传修饰，在真核生物和原核生物之间的模式、功能和生物学效应显著不同。利用CpG甲基化密度差异，固定在顺磁珠上的工程化甲基CpG结合结构域可以选择性捕获和去除甲基化宿主DNA。这一原理构成了NEBNext微生物组DNA富集试剂盒的基础。

纳米孔测序由牛津纳米孔技术公司开发，通过监测DNA分子通过纳米孔时的电流变化实现实时长读长DNA测序。与Illumina等传统短读长测序平台不同，纳米孔技术促进快速数据采集和分析，为现场和时间敏感应用提供独特优势。纳米孔测序的一个独特特征是其选择性测序能力，由ReadUntil技术实现，该技术允许实时分类DNA分子，以根据电信号的计算分析决定是继续测序还是 eject 不需要的分子。

挑战与机遇

当前宿主去除方法的效率和特异性仍然是主要关注点，许多策略难以平衡有效的宿主DNA去除和微生物序列的保存。叶绿体和线粒体等细胞器DNA的丰度进一步复杂化了这一问题，这些DNA在大小、GC含量和序列特征上模拟细菌基因组特征，导致宿主读长的过度代表和微生物信号的掩盖。

各种宿主去除技术可能引入偏向性，偏爱或排除某些微生物类群，可能扭曲观察到的微生物群落组成。这些偏向性使比较分析复杂化，并可能导致宏基因组数据的误解。此外，宿主去除方法的有效性在不同样本类型（包括植物区室和物种）间差异显著，使得开发普遍有效的方法具有挑战性，并需要样本特异性优化。

准确量化微生物负荷对于评估宿主DNA去除策略的效率和解释宏基因组数据至关重要。使用内部spike-in对照（如合成DNA片段或已知微生物标准）能够实现微生物含量的绝对量化。此外，定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）靶向通用微生物基因（如16S rRNA基因）可用于量化微生物类群的绝对丰度。

新兴技术展望

CRISPR-Cas系统为改进宿主DNA去除提供了有前景的新途径。Cas9核酸酶与特定guide RNA（gRNA）结合，可以靶向并切割水稻16S rRNA基因，在扩增子测序中减少宿主污染。通过设计gRNA靶向宿主基因组的重复或高拷贝区域，Cas9可以将宿主DNA片段化成短片段（如1-2 kb），留下微生物DNA作为长片段用于长读长测序。

染色质免疫沉淀（ChIP）为基础的宿主DNA去除是另一种有前景的方法，利用宿主和微生物染色质之间的结构差异。甲醛交联通过创建DNA和相关蛋白质之间的稳定键来保存染色质结构，从而稳定宿主染色质。细胞裂解和控制性片段化后，抗组蛋白抗体可以更有效和选择性地结合宿主染色质，实现其免疫沉淀。通常不与组蛋白相关的微生物DNA保留在未结合的上清液中，可以纯化用于宏基因组测序。

结论

理解植物-微生物互作对于推进可持续农业、提高作物韧性和促进生态系统健康至关重要。虽然宏基因组学通过实现对微生物群落结构和功能的全面、不依赖培养的分析，革命性地改变了植物微生物组研究，但其在低生物量植物区室（如叶际和内生圈）的应用仍然有限。这主要是由于高水平的宿主DNA污染，可能掩盖微生物信号并影响测序效率。

通过高效和特异性的去除策略，我们才能充分利用宏基因组学来揭示植物相关微生物生态系统的全部广度及其对农业韧性的功能贡献。完善和标准化宿主去除方法对于将宏基因组学扩展到先前未充分探索的植物生态位至关重要。更高效和特异性的去除技术将使研究人员能够获取高质量微生物基因组数据，深化功能分析，并揭示植物相关微生物群落的生态动态。