基于双特异性兔单克隆抗体与纳米酶-生物酶复合物的自动化微流控生物传感器用于双抗生素检测

本文报道了一种创新性微流控生物传感器，通过基因工程技术首次成功筛选出氟苯尼考（FF）和甲砜霉素（THF）双特异性兔单克隆抗体（rmAb），并构建了具有优异过氧化物酶模拟活性的AuPtCu@HRP-hapten复合纳米酶-生物酶标记物。该传感器将免疫反应集成于单一微流控芯片，结合智能手机检测策略，可在30分钟内实现对河水中FF和THF的超灵敏检测（检测限分别达0.014 ng/mL和0.015 ng/mL），回收率优异（96.58%-104.50%），为标准ELISA提供了高效、精准的现场检测替代方案。

　　

1 引言

近一个世纪以来，抗生素被广泛用于预防和治疗动物疾病。这种广泛使用，加上持续排放到环境中，导致抗生素残留物在动物源性食品和自然生态系统中积累，对公众健康和生态稳定构成重大威胁。其中，氟苯尼考（FF）和甲砜霉素（THF）作为氯霉素（CAP）的衍生物，是常用于治疗牲畜细菌感染的广谱抗生素。令人担忧的是，FF和THF残留物经常在环境水体中被检测到，引发了关于它们在人类食物链中潜在积累及相关健康风险（如骨髓造血功能障碍、粒细胞缺乏症和溶血性贫血）的担忧。因此，开发高灵敏度、精确的FF和THF残留检测方法势在必行。

酶联免疫吸附测定（ELISA）因其利用抗体和酶介导的显色反应来识别目标物而被广泛用于环境水质评估。然而，传统的ELISA方法由于抗体亲和力、酶活性以及操作程序复杂等方面的限制，在检测复杂基质中的痕量污染物时常常遇到困难。因此，探索高亲和力抗体和自动化信号放大策略，以提高快速抗生素检测的准确性、灵敏度和操作简便性至关重要。

先前的研究主要集中在筛选用于FF和THF检测的小鼠单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体（pAbs）。值得注意的是，mAbs具有高特异性、一致性、稳定供应和鲁棒性等显著优势，这对于在各种应用中实现准确可靠的检测至关重要。虽然小鼠mAbs效果良好，但兔mAbs具有更优越的亲和力和特异性、更广泛的表位识别能力以及对小分子表位（如抗生素）更强的反应能力等优势。因此，针对小分子抗生素筛选兔mAbs可以显著提高ELISA传感器的性能。然而，兔杂交瘤系统中融合和转化事件的不稳定性和低效性，历史上阻碍了兔mAbs在生物传感技术中的广泛应用，成为该领域的一个瓶颈。

此外，ELISA中使用的天然酶（如辣根过氧化物酶HRP）的性能可能受到温度、pH值和表面活性剂等因素的不利影响。近年来，“纳米颗粒-天然酶”复合物的开发受到关注，因为这些复合物能增强酶活性和稳定性，使其成为比色免疫分析的理想候选者。纳米酶因其具有类酶催化特性，且具有优异的催化性能，在生物传感应用中崭露头角。贵金属纳米颗粒及其合金因其独特的物理化学性质（包括可调的尺寸、结构和光电特性）、卓越的类酶活性、优异的生物结合能力以及在复杂生物系统中的非凡稳定性，已成为生物传感应用中天然酶的高度有前景的替代品。然而，单金属纳米酶由于其元素限制，表现出有限的催化多功能性，通常显示受限的反应途径。铂基和金基多金属合金纳米酶作为优良催化剂受到特别关注，与单金属系统相比，它们提供了增强的催化性能同时减少了铂的消耗。这些多金属合金纳米结构表现出显著改善的响应动力学、操作稳定性和催化效率，这主要归因于组分间的电子耦合效应。值得注意的是，PtCu和AuPt合金纳米结构因其组成金属之间有效的电荷转移和显著的协同效应而被广泛研究，这些共同有助于其相对于单组分对应物增强的化学稳定性和电化学活性。通过充当三维支架，多金属合金纳米酶可以稳定和固定天然酶，从而放大比色信号。然而，在设计稳定的纳米酶支架和包封策略以确保最佳酶负载并保持协同催化活性方面仍然存在挑战。

传统的ELISA程序通常繁琐，涉及多次孵育和洗涤步骤，既费时又费力。虽然自动化ELISA系统存在，但其复杂性和高成本限制了其可及性。因此，迫切需要高效且经济实惠的自动化系统来简化传统的ELISA工作流程。微流控技术通过实现免疫测定的自动化、减少样品和试剂用量以及最小化废物，提供了一种变革性的解决方案。将多个分析过程集成到单个微流控芯片上可以增强反应动力学，从而实现更快、更灵敏的检测。此外，微流控系统可以与传统ELISA和便携式数据管理工具无缝集成，促进实时监测和高效工作流程。这些能力共同提高了生物传感器的效率、灵敏度和可靠性。然而，在集成各种ELISA组件（例如抗体的精确组装和微尺度流体控制）方面仍然存在挑战。

在本研究中，我们提出了一种快速检测FF和THF残留物的新方法，首先利用噬菌体展示技术筛选出FF/THF双特异性兔单链抗体（scFv），然后通过基因技术构建了全长IgG兔单克隆抗体（rmAb），克服了先前兔杂交瘤系统的局限性。为了进一步提高检测灵敏度，我们使用简单的一锅水相法开发了一种具有过氧化物酶（POD）模拟活性的高度稳定的AuPtCu纳米酶。通过化学偶联合成了半抗原修饰的HRP（HRP-hapten），随后通过静电吸附将其固定在AuPtCu纳米酶上，形成AuPtCu@HRP-hapten级联纳米酶-生物酶免疫标记。AuPtCu纳米酶不仅表现出固有的POD模拟活性，而且还作为HRP-hapten缀合的有效支架，创建了一个协同催化系统，增强了整体的POD样性能。此外，我们设计了一种微流控芯片，通过在蛋白A微球表面以特定方向捕获rmAbs，集成了直接竞争性ELISA。这种创新的微流控平台，结合用户友好的智能手机应用程序，能够快速准确地检测环境水样中的FF/THF，显著简化了工作流程，增强了现场监测的可行性。

2 结果与讨论

2.1 基于噬菌体展示的兔mAb筛选

为了确保所选半抗原（FF琥珀酸盐）的合理性和实用性，我们首先评估了其与FF/THF在电子和构象特性方面的原子相似性。FF分子的空间负静电势（ESP）区域（红色表示）集中在羰基（-C=O）周围，而正ESP域（蓝色表示）主要位于羟基（-OH）的氢原子上。在半抗原中，尽管-OH基团被琥珀酸臂取代，但长链烷基部分中的-CH₂基团在相应位置提供了类似的正电域。此外，半抗原的最低能量空间构象与FF和THF高度一致，叠加相似度分别为0.875（FF）和0.836（THF）。这种一致性表明，尽管刚性存在差异，但半抗原与FF和THF保持了显著的电子和构象相似性。

然后将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和钥孔血蓝蛋白（KLH）缀合，分别作为免疫原（KLH-hapten）和包被抗原（BSA-hapten）。抗体效价（定义为使最大光密度OD_max达到1.0的抗血清稀释度）随着后续免疫次数的增加而急剧上升，在第四次免疫后趋于稳定。值得注意的是，2号兔的抗血清效价（1/8000）高于1号兔（1/4000）。

从1号兔和2号兔获得的抗血清均特异性识别FF，其中2号兔显示出比1号兔更优越的亲和力（IC₅₀分别为9.91 ng/mL和15.02 ng/mL）。此外，免疫兔的抗血清对THF表现出高交叉反应性（CR）（2号兔CR = 83.07%；1号兔CR = 51.88%），显示出对FF和THF潜在的双特异性识别活性。而且，2号兔的抗血清对其他测试的抗生素（包括CAP、氟苯尼考胺FFA、多西环素DOX和头孢羟氨苄CFR）识别度低。因此，2号兔在免疫对象中表现出更高的抗血清效价和增强的抗原结合亲和力，被选用于后续rmAb的开发。

从第5次免疫后处死的2号兔脾脏中收获的淋巴细胞中制备cDNA，用于扩增可变区基因（轻链和重链）。随后转化入XL1-Blue大肠杆菌并进行噬菌体库表达扩增后，产生了一个浓度为1.7 × 10¹² cfu/mL转化子的噬菌体展示抗体库。在经过抗原包被的固相上进行两轮连续淘选后，观察到特异性噬菌体的明显富集。从第二轮淘选后的滴定板中随机挑选20个克隆，所有克隆在噬菌体ELISA中均呈阳性。其中，通过DNA测序鉴定出四个不同的克隆。

认识到ScFv抗体通常比全长抗体稳定性差，我们旨在构建一个全长抗体。将轻链和重链基因分别克隆到pABm-rKappa和pABm-rIgG载体中，用于在HEK 293细胞中共表达。得到的IC₅₀值分别为：A03-IgG为10.09 ng/mL，C04-IgG为20.75 ng/mL，C10-IgG为18.06 ng/mL。基于这些结果，选择A03-IgG用于后续实验。A03-IgG的SDS-PAGE分析显示，在非还原状态下有一条150 kDa的单一条带，而在还原状态下显示两条条带，分别为50 kDa（重链）和25 kDa（轻链），证实了IgG rmAb的成功制备。A03-IgG在转换为全长IgG格式后，对FF和THF（CR = 86.98%）也表现出优异的特异性，并且未检测到与其他抗生素分子（CAP, FFA, DOX, CFR）的交叉反应。分子对接分析显示，THF和FF都能有效地被抗体结合口袋识别，表现出强烈的结构对齐。VH CDR2域中的关键残基（CYS182, SER183, GLY184）以及VH CDR3域中的ARG235关键地介导了对FF和THF的双重识别。

2.2 AuPtCu纳米酶的表征

使用Pt (IV)、Cu (II) 和 Au (III) 离子作为金属前体，NaBH₄作为还原剂合成了AuPtCu纳米颗粒。纳米颗粒表现出显著的单分散性和均一性，平均直径约为6 nm。高角环形暗场（HAADF）/透射电子显微镜（TEM）成像和元素 mapping 证明了Au、Pt和Cu在纳米颗粒上的均匀分布。此外，能量色散X射线光谱（EDS）和X射线衍射分析证实了AuPtCu纳米颗粒由Au、Pt和Cu组成，表明这些金属成功偶联到纳米颗粒上。

使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）作为底物评估了AuPtCu纳米颗粒的POD模拟活性。在该催化系统中，纳米酶促进了H₂O₂介导的TMB氧化，产生特征性的蓝色氧化产物（oxTMB）。紫外-可见光谱显示，在TMB-H₂O₂系统中，HRP和制备的AuPtCu纳米酶都产生了显著的蓝色变化，在370 nm和650 nm处有清晰的吸收峰。在该系统中，TMB的氧化强烈依赖于给定条件下AuPtCu纳米酶的浓度。

2.3 AuPtCu@HRP-hapten的表征与动力学

AuPtCu@HRP-hapten免疫标记的制备涉及两个主要步骤：（i）使用乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学将羧基化半抗原缀合到HRP表面，创建HRP标记的半抗原（HRP-hapten）；（ii）通过静电吸附将AuPtCu和HRP-hapten结合。紫外-可见吸收光谱显示，半抗原在262、267和274 nm处有特征峰，而HRP在280和400 nm处有吸收峰。缀合后，HRP-hapten显示出HRP和半抗原的组合吸收峰，证实了HRP-hapten的成功制备。AuPtCu纳米颗粒的Zeta电位为-20.87 ± 0.61 mV，与HRP-hapten结合后变为-6.60 ± 1.20 mV，进一步验证了AuPtCu@HRP-hapten的成功制备。HAADF/TEM成像和EDS mapping 证实了AuPtCu纳米颗粒中Au、Pt和Cu元素的存在，以及HRP蛋白的特征性P和S元素在纳米颗粒表面的均匀分布，清楚地证明了AuPtCu@HRP-hapten三维纳米颗粒的形成。

将AuPtCu@HRP-hapten的POD样活性与HRP和AuPtCu进行了比较。在650 nm处的紫外-可见吸收峰表明，在相同条件下，AuPtCu@HRP-hapten纳米颗粒对TMB在H₂O₂存在下的吸光度响应显著高于HRP和AuPtCu，等离子体激元激发将TMB的氧化增强了1.2倍（与HRP相比）和2.1倍（与AuPtCu相比），表现出强大的等离子体增强纳米酶活性。

使用米氏曲线和Lineweaver-Burk图计算了AuPtCu@HRP-hapten的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。与AuPtCu纳米酶相比，AuPtCu@HRP-hapten表现出更优越的底物亲和力和催化效率，Km为0.20 mM，Vmax为0.16 μM/s。这些发现表明，AuPtCu@HRP-hapten具有比AuPtCu（Km = 0.32 mM, Vmax = 0.13 μM/s）和HRP显著更高的POD样活性。动力学数据表明，合成的AuPtCu@HRP-hapten复合材料表现出优异的底物亲和力和反应速率。

2.4 微流控ELISA的优化

我们开发了一种高通量、自动化的微流控ELISA，通过使用筛选出的双特异性rmAb作为识别元件和AuPtCu@HRP-hapten作为免疫标记，用于灵敏、准确地检测FF/THF。该系统使用蛋白A功能化的琼脂糖微球作为免疫反应载体进行信号放大，用自动化的微流控芯片取代了传统的多步ELISA技术。

在检测过程中，将含有rmAbs和蛋白A功能化琼脂糖微球的溶液通过入口注入，并被中间的滤膜捕获，作为免疫反应载体。rmAb的Fc域定向结合到琼脂糖微球表面的蛋白A上，充分暴露抗体的活性位点。随后，注入封闭溶液，然后引入含有AuPtCu@HRP-hapten免疫标记的样品，完成竞争性免疫反应，形成AuPtCu@HRP-hapten-微球复合物。当检测室中预加载了H₂O₂-TMB底物时，该复合物催化无色的TMB转化为蓝色的氧化产物，模拟传统的酶活性。据我们所知，这是首次报道使用自动化微流控芯片和纳米酶-生物酶杂交材料来灵敏、高效检测痕量FF/THF的免疫分析法。

我们以FF为目标，优化了测定中使用的封闭溶液。将AuPtCu@HRP-hapten免疫标记与浓度为100 ng/mL的FF或PBS（阴性对照）反应，使用ImageJ软件分析催化后的图像以获得灰度值。使用40%脱脂奶粉封闭蛋白A功能化的琼脂糖微球，在100 ng/mL FF样品和阴性对照之间产生了最大的灰度值差异。这表明40%脱脂奶粉能有效封闭抗体捕获的琼脂糖微球，与测试的其他条件相比，产生了显著的免疫反应抑制率。

接下来，我们评估了四种常用滤膜（孔径分别为0.22、0.5、1.2和5 μm）在该生物传感器中的性能。阴性对照的灰度值随着孔径从0.22 μm增加到5 μm而从74.19下降到35.64。在100 ng/mL FF和阴性对照之间，灰度值的最大差异出现在孔径为5 μm时。这归因于较小的孔径在洗涤步骤中容易被废物组分堵塞，导致免疫反应后AuPtCu@HRP-hapten被困在孔中，产生高背景比色信号。滤膜在生物传感后的SEM图像支持了这一观察结果，显示所有测试的滤膜都能有效捕获琼脂糖微球。然而，大多数较小尺寸的孔径（0.22和0.5 μm）以及部分1.2 μm的孔径在显色步骤后被反应废物堵塞，而在5 μm的孔径中没有观察到明显的堵塞。

当使用的rmAbs达到40 μg时，灰度值增加并趋于平稳，但随着rmAbs的进一步增加略有下降。这表明过量的rmAbs可能在蛋白A功能化的琼脂糖微球上引起显著的空间位阻，阻碍AuPtCu@HRP-hapten与抗体捕获的琼脂糖微球结合，从而削弱显色。

使用不同量的HRP-hapten制备1 mL AuPtCu@HRP-hapten免疫标记，然后测试其对100 ng/mL FF和PBS的反应。当HRP-hapten浓度从8 μg增加到12 μg时，灰度值从53.75增加到78.02。进一步增加HRP-hapten对阴性对照的灰度值没有显著影响。此外，FF的灰度值保持较低水平，导致FF和阴性对照样品之间的差异最大。当微流控ELISA在25°C下进行时，传感器对阴性对照获得了最高的灰度值，最大化了FF和阴性对照样品之间的差异。

阴性对照的灰度值随着pH从4增加到7而从36.95增加到81.03，但进一步增加pH导致灰度值显著下降。同时，100 ng/mL FF的灰度值在pH为7时保持持续较低。

2.5 微流控生物传感器的性能

我们设计了一个便携式相机外壳，并开发了一个智能手机应用程序，以确保一致的环境光线并保持固定的距离来拍摄芯片检测室的照片。该智能手机应用程序的工作流程采用色调、饱和度、明度颜色模型，特别关注饱和度通道。这个四步工作流程能够在30分钟内实现精确高效的检测，与传统直接竞争性ELISA方法相比，显著缩短了检测时间并提高了效率。

为了建立该生物传感器的校准模型，测试了PBS缓冲液中浓度范围为0.02至20 ng/mL的不同浓度的FF/THF。使用智能手机应用程序和ImageJ软件测量检测室中催化产物的饱和度。通过绘制样品组与空白组之间的灰度值差异ΔG对分析物浓度作图，生成定量校准曲线。在ImageJ分析中，当FF浓度从0.02 ng/mL增加到20 ng/mL时，ΔG从76.71下降到24.83。在FF浓度0.08–20 ng/mL范围内观察到线性关系，表示为ΔG = 50.98 ? 20.22X（R2 = 0.999）。当抗体结合位点被AuPtCu@HRP-hapten缀合物完全占据时，ΔG信号强度在0.02 ng/mL FF时达到饱和。基于3倍信噪比计算出的检测限为0.021 ng/mL。当使用智能手机应用程序处理时，收集ΔS（样品组与空白组之间的饱和度值差异），在相同浓度范围内线性关系表示为ΔS = 123.59 ? 66.29X（R2 = 0.996），获得了改进的LOD为0.014 ng/mL。对于THF，使用基于ImageJ的传感策略，在THF浓度范围0.08–20 ng/mL内观察到线性关系ΔG = 50.75 ? 17.88X（R2 = 0.999），计算出的LOD为0.023 ng/mL。当通过智能手机应用程序处理时，在相同浓度范围内线性关系为ΔS = 123.07 ? 63.97X（R2 = 0.999），实现了增强的LOD为0.015 ng/mL。这些结果表明，便携式传感设备和智能手机应用程序增强了便携性，减少了检测时间，并提高了灵敏度。

为了评估生物传感器的特异性，选择了几种FF/THF类似物和常见抗生素，包括CAP、FFA、喹诺酮QIO、CFR和DOX作为阴性对照。FF和THF的存在导致检测室几乎无色，而对照样品呈现明显的蓝色。即使对照浓度是FF/THF的10倍，从智能手机（ΔS）和ImageJ（ΔG）方法获得的对照样品的信号值也显著高于FF和THF。这些发现证明了自动化微流控ELISA对FF和THF的高度特异性。

我们还使用FF/THF空白河水校准了定量校准曲线，以评估样品基质的影响。智能手机分析在0.08–20 ng/mL FF范围内产生了可靠的线性关系（ΔS = 120.87 ? 64.54X），R2为0.999。类似地，对于THF，获得了线性关系，可表示为ΔS = 121.85 ? 62.79X（R2 = 0.999）。这些结果表明，所开发的自动化微流控ELISA受河水样品基质的影响最小。

为了进一步验证该生物传感器的检测性能，将三种不同浓度（0.1、1和4 ng/mL）的FF和THF标准品添加到先前通过液相色谱-质谱法验证的河水中。计算了在这些目标浓度下加标河水样品的回收率和标准偏差。基于ImageJ的分析得出的平均回收率值在95.86%至104.37%之间，SD低于8.53%。基于智能手机的分析显示平均回收率在96.58%至104.50%之间，SD范围在2.13%至5.34%之间。这些结果表明，与标准LC-MS方法相比，定量检测FF和THF具有可接受的准确度和精密度。

FF、THF和CAP是常用的CAP衍生物，具有相似的分子结构。为了评估生物传感器在CAP存在下同时检测FF和THF的能力，将CAP、FF和THF的混合标准品加标到河水样品中。然后使用开发的微流控ELISA芯片测试这些盲样。FF和THF检测方程都成功地定量了FF和THF的总浓度，即使在存在CAP干扰的情况下。然而，在同时检测FF和THF时，FF检测方程表现出更高的准确性。检测结果通过LC-MS标准方法进一步验证。

3 结论

总之，我们开发了一种自动化微流控ELISA系统，利用AuPtCu@HRP-hapten纳米酶-生物酶免疫标记，用于便携、简单、灵敏、准确地检测河水中的抗生素FF和THF。通过噬菌体展示和基因工程技术，成功筛选并构建了具有高亲和力的FF/THF双特异性兔rmAb作为识别元件。AuPtCu@HRP-hapten纳米酶-生物酶纳米颗粒通过非破坏性地将rmAbs捕获在作为免疫反应载体的蛋白A功能化琼脂糖微球上，展示了放大比色信号的卓越能力。此外，我们将微流控芯片与智能手机应用程序集成，创建了一个便携式传感设备，在保持高灵敏度和准确性的同时，增强了便携性并简化了操作步骤。开发的生物传感器在30分钟的分析窗口内实现了对FF和THF的检测限分别为0.014 ng/mL和0.015 ng/mL。这与传统的竞争性ELISA方法（通常需要9个步骤，耗时4小时以上）相比，检测时间减少了超过87.5%。此外，与一些现有的FF和THF检测平台相比，自动化微流控ELISA系统表现出卓越的灵敏度和快速响应。这是关于筛选FF/THF双特异性rmAb及开发相应微流控生物传感器的首次报道。这种简单的生物传感器展示了在低成本、快速、高灵敏度的现场抗生素检测方面的巨大潜力。