利用载有可注射水凝胶的3D打印支架体外自由植入根尖乳头干细胞以增强体内组织有序化和血管浸润

本研究开发了一种结合3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）支架与羧甲基壳聚糖（CMCTS）/氧化透明质酸（oHA）可注射水凝胶的创新策略，用于高密度根尖乳头干细胞（SCAPs）的即时移植。该体系无需体外预培养即可实现快速细胞接种、高效组织整合和成熟血管网络形成，为急诊硬组织缺损修复提供了突破性解决方案。

　　

2.1 CMCTS/oHA水凝胶与3D打印PMMA支架的特性表征

研究采用羧甲基壳聚糖（CMCTS）与氧化透明质酸（oHA）构建的可注射水凝胶系统修饰3D打印聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）支架。通过¹H NMR光谱在4.9-5.1 ppm处检测到的半缩醛质子峰证实了oHA二醛基团的成功合成。流变学分析显示4% CMCTS/3% oHA水凝胶具有更高的储能模量（G′）和损耗模量（G″），表明其凝胶结构稳定性显著优于低浓度组。在低频区（低于6 Hz）G′始终高于G″，表现为以弹性为主的稳定凝胶行为，而在高频区模量曲线交叉则揭示了凝胶内可逆交联的特性，这种特性同时保证了凝胶的注射性能。

采用熔融沉积成型（FDM）技术制备的四层网格状PMMA支架具有400 μm的纤维直径和孔隙尺寸，光学显微镜显示其具备完全互连的多孔结构。压缩测试表明水凝胶修饰的复合支架（3D scaffold + CMCTS/oHA）压缩模量为81.23±2.643 MPa，虽略低于纯支架的100.9±10.34 MPa，但仍显著高于人体松质骨的正常范围（0.2-80 MPa），完全满足硬组织工程的机械强度要求。体外降解实验显示支架上的水凝胶在7天内几乎完全降解，第1天即快速降解40%，这种快速降解特性有利于细胞的快速释放和粘附。

2.2 高密度SCAP负载的CMCTS/oHA修饰3D支架的体外表征

将高密度根尖乳头干细胞（SCAPs）以1×10⁸ cells/mL的浓度封装于CMCTS/oHA水凝胶并注入3D支架后，体外培养7天显示显著细胞聚集现象。培养初期（0天），单个细胞松散分布于支架孔隙中；从第1天开始，随着水凝胶自发降解，高密度细胞开始凝聚并自组装成多个3D细胞簇附着于支架表面。活死染色显示培养7天后支架表面形成密集的活细胞凝聚体，无死细胞检出。CCK-8检测表明水凝胶组细胞数量呈指数增长，且细胞保留率显著高于直接接种组。F-actin染色显示水凝胶组存在丰富的长肌动蛋白应力纤维，扫描电镜（SEM）和苏木精-伊红（H&E）染色进一步证实了细胞聚集和细胞基质形成。

2.3 SCAPs/CMCTS/oHA负载3D复合支架的体内移植

将细胞负载复合支架直接植入小鼠背部皮下（无体外预培养），3周后观察到显著的组织整合现象。宏观观察显示两组移植部位均形成致密组织样结构，复合支架组可见组织与支架紧密整合，组织呈现红色表明血液供应充足。显微CT扫描显示支架与天然组织间无间隙，垂直和水平切面均显示血管浸润（黄色箭头）深入支架结构内部。组织学分析显示所有染色中均观察到血管结构，Masson三色染色显示复合支架组在整个支架孔隙中形成更显著的血管网络。新浸润的脂肪组织与植入的SCAP簇形成的血管系统呈现紧密互连状态。

3 结论

该研究成功开发了CMCTS/oHA封装高密度SCAP的3D打印PMMA复合支架，作为一种有前景的即时移植策略。FDM基3D打印技术实现了快速可控的支架制备，CMCTS/oHA水凝胶表现出优异的可注射性和自发降解特性，能够以均匀方式封装高密度细胞，显著提高3D打印支架的细胞修饰效率。体外评估证实复合支架具有良好的生物相容性，有效促进了人牙源性干细胞的附着和聚集。体内皮下植入结果显示术后3周成功实现组织支架整合和血管浸润。

这种结合高密度细胞水凝胶和3D打印支架的混合策略，无需支架表面修饰或体外预培养即可促进血管浸润，有效解决了组织工程领域硬组织损伤急诊治疗的挑战，为临床应用开辟了新途径。

4 实验方法

研究使用Novus Life Sciences提供的纳米羟基磷灰石涂层PMMA-HEMA共聚物3D打印丝材，通过Flashforge Adventurer 4 Pro打印机制备支架。氧化透明质酸（oHA）采用高碘酸钠氧化法合成，CMCTS/oHA水凝胶按80:20比例混合形成。SCAPs从人类未成熟第三磨牙的根尖乳头组织中分离培养，使用3 mg/mL I型胶原酶消化获得。细胞以1×10⁸ cells/mL密度封装于水凝胶后注入支架。动物实验采用SCID小鼠皮下植入模型，100 μL植入物含1×10⁷ cells。术后3周通过显微CT和组织学（H&E、阿利新蓝、沙红O、Masson三色染色）进行评估分析。