洞穴等足目种群基因组分化揭示物种鉴定中的不确定性及其对生物多样性保护的意义

本研究通过基因组单核苷酸多态性（SNP）分析，揭示了意大利和瑞士前阿尔卑斯地区洞穴等足目Monolistra属物种的显著遗传分化，发现形态学分类与基因组数据存在重大冲突，强调了整合基因组方法在物种界定及地下生物多样性保护中的关键作用。

　　

1. 引言

地下环境蕴藏着全球生物多样性的重要组成部分，但洞穴生物学仍主要依赖形态学进行物种划分。形态特征常因隐存种、趋同进化或表型可塑性而产生误导，因此遗传数据已成为分类研究的重要工具。基因组信息可望改善洞穴动物的物种鉴定并指导保护实践。甲壳纲等足目Monolistra属是洞穴适应生物的典型代表，其进化历史研究尚不充分。该属从巴尔干地区的迪纳拉山脉延伸至西前阿尔卑斯山，形态多样性高，分为五个亚属。早期分子数据表明该属可能于约500万年前的中新世盐度危机期间从海洋祖先迁入洞穴环境，而更新世冰期可能促进了物种分化。然而，以往研究仅使用同工酶或少数线粒体与核基因，且限于喀斯特高原东部和迪纳拉山脉的物种，阻碍了对该属整体关系的全面认识。

2. 材料与方法

2.1. 采样

根据物种已知地理分布，于2019至2022年间在21个地点共采集73个Monolistra个体。物种鉴定基于外部形态特征，包括尾足存在与否、尾节形态和雄性第二胸肢形态。样本保存于-20°C无水乙醇中。

2.2. DNA提取与ddRADseq文库构建

使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒提取基因组DNA，并通过双酶切ddRADseq方法构建文库。使用PstI和EcoRI内切酶消化DNA，连接条形码接头，经片段选择、扩增和纯化后，在NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序。

2.3. SNP calling与数据过滤

使用Stacks v2.60进行位点重建和SNP calling。过滤覆盖度低于5或高于200的基因型，剔除杂合度过高（>0.5）的SNP，保留缺失率低于20%的位点，并去除稀有等位基因（次要等位基因计数≤2）和物理连锁的SNP（每个位点随机保留一个SNP）。

2.4. 系统发育树重建

基于位点一致序列（包含变与不变位点）构建最大似然（ML）物种树，使用CAT模型和RAxML v8.2.12进行快速自举及ML搜索。同时基于多位点合并树（multispecies coalescent, MSC）模型，用ASTRAL-III估计基因树，并通过四分体得分比较不同拓扑结构的支持度。

2.5. 种群结构分析

使用adegenet包进行主成分分析（PCA）和判别分析（DAPC），通过K均值聚类确定最佳遗传簇数量（K）。利用ADMIXTURE v1.3.0推断全局种群结构，测试K=1至19（对应采样点数量），以最小化交叉验证误差（CVE）确定最佳K值。

2.6. 遗传分化分析

使用hierfstat包计算群体间 pairwise F_ST（Weir and Cockerham），并通过分子方差分析（AMOVA）评估遗传变异的等级结构，利用10000次蒙特卡洛置换检验显著性。

3. 结果

3.1. 从头序列组装

共获得1.65亿条reads，平均每个个体230万条reads。过滤后保留54个个体（分属6物种，19个种群），最终数据集包含2545个位点。平均个体覆盖度为49.40X，缺失率为11.95%。

3.2. 系统发育关系

物种树支持度高（bootstrap support, BS≥99），揭示了7个分化明显的进化枝（Clade A–G），枝尖平均遗传距离<0.01。基因树与物种树存在部分冲突，尤其在枝D的定位上，表明基因树拓扑结构存在显著不一致。

3.3. 种群结构

PCA前四个轴解释了71.5%的遗传变异，显示出与系统发育一致的遗传分组。ADMIXTURE分析最佳K=10或11，所有样本均按进化枝清晰聚类。枝内种群分化明显，除LIN和PIO（属同一洞穴系统）外，每个洞穴种群均遗传可区分。

3.4. 遗传分化

枝间遗传分化极高（F_ST=0.77–0.96），占遗传变异的78.2%；枝内种群分化较低（平均F_ST=0.17–0.79），占18.0%；个体间变异不显著（0.1%），样本内变异低（3.7%）。

4. 讨论

4.1. ddRADseq在评估枝内与枝间多样性中的应用

基因组SNP数据高效揭示了Monolistra属高水平的枝间和枝内遗传分化。枝D（含FAU种群）在物种树与基因树中的定位冲突及部分枝的低支持度，可能源于祖先变异的不完全谱系排序或近期快速分化。

4.2. 基因组数据与现行分类学的冲突

研究发现形态学鉴定的M. bergomas实际上包含3个独立进化枝（Clade D、E、F），建议将FAU种群重新归类为M. boldorii。枝E、F、G（对应现行M. bergomas与M. pavani）遗传分化显著（F_ST>0.95），应视为独立进化单元。整合形态与遗传数据的分类修订势在必行。

4.3. 遗传分化的空间格局

进化枝呈东西梯度分化，东部（M. julia、M. racovitzai、M. lavalensis、M. berica）与西部（M. bergomas、M. pavani）种类各有共同祖先，加尔达湖可能是其地理屏障。现代湖泊（如科莫湖、伊塞奥湖）阻碍基因流，促进种群分化；而同一洞穴系统的种群（如LIN与PIO）遗传一致。洞穴限制性生物同样呈现地理隔离模式。

5. 结论

该研究揭示了Monolistra属物种内部存在显著且以往未被认识的遗传多样性，其真实物种多样性可能远超当前认知。准确物种界定是识别进化显著单元的基础，对地下生物多样性保护至关重要。每个洞穴系统拥有遗传独特的种群，基因流受限，易受环境变化威胁，因此保护多个洞穴生境对维持遗传多样性和生态系统功能具有重要意义。