化学诱导二聚化GSDMD C端结构域阻断N端介导的细胞焦亡的创新策略

本研究针对GSDMD C端结构域(GD-CT)抑制焦亡效率低的问题，通过构建膜靶向且可化学诱导二聚化的嵌合蛋白FKBP-GD-CT，利用AP20187诱导二聚化增强其稳定性与膜定位，显著提升了抑制GD-NT介导的焦亡效率，为焦亡相关疾病治疗提供了新策略。

　　

细胞焦亡（pyroptosis）是一种由gasdermin家族蛋白介导的程序性细胞死亡方式，在免疫防御和炎症性疾病中扮演着双重角色。作为焦亡的关键执行者，GSDMD蛋白被 caspase切割后释放出具有孔道形成能力的N端结构域（GD-NT）和具有抑制功能的C端结构域（GD-CT）。然而奇怪的是，尽管GD-CT仍能与GD-NT结合，却无法有效阻止焦亡的发生。这一矛盾现象背后的机制长期以来并不明确，限制了基于GD-CT的焦亡调控策略的开发。

为了揭开这个谜团，研究人员首先建立了293-tetO-GD-NT细胞模型，通过多西环素（Dox）诱导GD-NT表达，从而专一性地研究GD-NT介导的焦亡过程。他们发现，GD-CT确实能够剂量依赖性地抑制焦亡，但最高只能达到约40%的抑制率，效率低下。通过结构预测分析，他们发现游离的GD-CT与GD-NT的复合物构象明显不同于全长GSDMD（GD-FL）中的天然抑制状态，这可能是其抑制能力减弱的原因之一。

进一步探究发现，GD-CT的细胞内分布和稳定性存在严重缺陷。通过共聚焦显微镜和亚细胞分级实验，研究人员证实GD-CT被限制在细胞质中，而GD-NT则能够转运至质膜上形成孔道——这种空间隔离使得GD-CT无法有效抑制膜上的GD-NT。更重要的是，蛋白质稳定性实验表明，GD-CT的半衰期极短，在4小时内即被完全降解，而这一过程可通过蛋白酶体抑制剂MG132阻断，说明其通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）被快速降解。与之相反，GD-NT则较为稳定。也就是说，当GSDMD被 caspase切割后，理论上应等摩尔产生的GD-CT和GD-NT，实际上却因为GD-CT的快速降解而失去平衡，导致大量GD-NT得以自由发挥其孔道形成功能。

基于这些机制认识，研究团队着手对GD-CT进行工程化改造。他们设计了一种新型嵌合蛋白——FKBP-GD-CT。该蛋白融合了三个关键元件：一是豆蔻酰化（Myr） motif（GSSKSKPKDPSQR），使其能够靶向质膜；二是两个FKBP12^F36V domain，使其能够通过化学诱导二聚化（CID）技术，在AP20187小分子诱导下发生二聚化。理论预测表明，AP20187的结合能够引起FKBP-GD-CT的构象变化。

实验验证表明，改造后的FKBP-GD-CT成功实现了膜定位，并能够在AP20187存在的情况下显著延长其半衰期。更重要的是，在293-tetO-GD-NT细胞和iBMDM巨噬细胞两种模型中，FKBP-GD-CT均表现出比天然GD-CT更强的焦亡抑制能力，且AP20187的加入能够进一步增强这种抑制效果。

本研究的关键技术方法包括：使用293-tetO-GD-NT诱导性细胞系和iBMDM巨噬细胞系作为研究模型；通过免疫印迹（IB）、免疫共沉淀（IP）和亚细胞分级技术分析蛋白表达与定位；采用共聚焦显微镜和荧光显微镜观察蛋白分布与细胞死亡；使用流式细胞术通过Annexin V/PI染色定量细胞死亡；通过CHX追踪和蛋白酶抑制剂处理评估蛋白质稳定性；利用AlphaFold3进行蛋白结构预测与分析；采用化学诱导二聚化（CID）技术设计并验证嵌合蛋白功能。

研究结果表明，GD-CT抑制效率低下的主要原因是其胞质局限性和快速蛋白酶体降解。工程化的FKBP-GD-CT嵌合蛋白通过豆蔻酰化修饰实现膜靶向，并通过AP20187诱导的二聚化作用增强稳定性，从而显著提高了对GD-NT介导焦亡的抑制能力。

这项研究不仅揭示了GSDMD调控的新机制，更重要的是开发了一种可调控的焦亡抑制工具。FKBP-GD-CT与AP20187的结合使用，首次实现了利用化学诱导二聚化技术精确调控细胞焦亡水平，为炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症等焦亡相关疾病的治疗提供了新的思路和潜在的治疗策略。该研究发表于《Cell Death Discovery》期刊，为gasdermin家族蛋白的功能调控和焦亡相关疾病的干预提供了重要的理论依据和技术平台。