纳米复合材料负载杂交水凝胶微针通过衰老细胞清除和胶原XVII介导的屏障修复重塑真皮微环境

本研究针对皮肤光老化中氧化应激导致的真皮微环境紊乱，开发了一种负载非瑟汀纳米脂质体的丝素蛋白/重组人胶原XVII杂交水凝胶微针（SC/F-HMNs）。该系统通过高效透皮递送非瑟汀选择性清除衰老成纤维细胞，并利用rhCol17修复表皮屏障，在体外和UVA诱导的光老化小鼠模型中均证实能显著改善皮肤皱纹、弹性，降低氧化损伤（4-HNE、8-OHdG）、DNA损伤（γH2A.X）及基质金属蛋白酶（MMP1/3）表达，重塑胶原/弹性纤维结构，为氧化应激相关皮肤疾病的治疗提供了创新策略。

　　

随着人口老龄化的加剧，皮肤衰老及其相关疾病日益成为全球性的健康挑战。皮肤作为人体最大的器官，不仅关乎外貌美观，更是反映机体整体健康状况的重要窗口。在皮肤衰老的复杂过程中，长期暴露于紫外线辐射是主要的外部驱动因素，其中长波紫外线能够穿透表皮直达真皮深层，诱导活性氧的大量产生，引发氧化应激、DNA损伤，最终导致皮肤细胞功能紊乱和衰老。这些衰老细胞会分泌一系列炎性因子和基质降解酶，即衰老相关分泌表型，进一步破坏真皮细胞外基质的稳态，形成胶原降解、弹性纤维断裂的恶性循环，表现为皮肤皱纹、松弛、干燥等典型的光老化特征。与此同时，表皮屏障功能也因紫外线损伤而减弱，水分流失加剧，角质形成细胞分化异常，使其无法有效保护其下的真皮组织，加剧了微环境的失调。因此，开发能够同时靶向清除真皮衰老细胞并修复表皮屏障功能的协同治疗策略，对于逆转皮肤光老化进程具有迫切需求和重要意义。

传统抗衰老手段，如局部涂抹抗氧化剂或口服药物，往往面临皮肤渗透性差、生物利用度低、靶向性不强以及潜在全身性副作用等局限。非瑟汀作为一种天然黄酮类化合物，被证实具有优异的清除衰老细胞的能力，但其水溶性差、化学不稳定性限制了其临床应用。另一方面，胶原XVII是表皮基底膜带的重要结构成分，对维持表皮干细胞稳态和屏障功能至关重要，但其在皮肤再生医学中的应用尚待深入探索。

为此，发表在《Materials Today Bio》上的这项研究，设计并构建了一种创新的杂交水凝胶微针系统。研究团队首先制备了透明质酸修饰的非瑟汀脂质体，利用透明质酸与成纤维细胞表面CD44受体的亲和性增强细胞摄取。随后，将载药脂质体封装入由甲基丙烯酰化丝素蛋白和甲基丙烯酰化重组人胶原XVII通过光交联形成的水凝胶网络中，最终制成可溶解的微针贴片。该SC/F-HMNs系统兼具优异的机械强度以实现皮肤穿透、可控的药物释放动力学以及良好的生物相容性。

研究的关键技术方法主要包括：纳米脂质体的制备与表征（透射电镜、动态光散射）、水凝胶的合成与理化性质评估（溶胀、流变、压缩、降解）、微针的制备与性能测试（形态、机械强度、皮肤渗透性、体内降解），并利用UVA辐照的人皮肤成纤维细胞体外光老化模型和BALB/c裸鼠体内光老化模型，通过细胞活力、增殖、迁移、活性氧水平、线粒体膜电位、DNA损伤、细胞周期、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、Western blot、RT-PCR、组织学染色（H&E、Masson、天狼星红、地衣红）、免疫荧光/组化等多种技术手段综合评价其治疗效果。

3.1. SC/F水凝胶的制备与表征

研究人员成功合成了HL@F纳米粒，其粒径约为125 nm，且透明质酸修饰显著增强了人皮肤成纤维细胞对其的摄取。SFMA/rhCol17MA水凝胶表现出良好的溶胀性能、力学强度和酶响应降解特性。将HL@F载入水凝胶后，SC/F水凝胶展现了比游离HL@F更缓慢的非瑟汀释放曲线。细胞毒性实验表明，在非瑟汀浓度20 μM以下时，SC/F水凝胶提取物对人皮肤成纤维细胞无显著毒性，具有良好的生物相容性。

3.2. SC/F-HMNs微针的制备与表征

制备的SC/F-HMNs微针阵列排列整齐，针尖呈金字塔形，高度约800 μm，宽度约200 μm。机械测试表明其具有足够的强度刺入皮肤。体外皮肤渗透实验显示，罗丹明B标记的微针能将荧光信号递送至真皮层约500 μm深度。小鼠体内应用显示，微针在72小时内逐渐降解，皮肤穿刺点可在90分钟内闭合，表明其具有良好的可降解性和皮肤安全性。

3.3. SC/F水凝胶体外恢复细胞生物学功能

在UVA诱导的光老化人皮肤成纤维细胞模型中，SC/F水凝胶处理显著促进了细胞的增殖和迁移能力。Western blot分析显示，SC/F水凝胶上调了转化生长因子-β的表达，并增加了胶原蛋白I和胶原蛋白III的合成，表明其有助于恢复成纤维细胞合成细胞外基质的功能。

3.4. SC/F水凝胶体外缓解氧化应激和线粒体功能障碍

通过DCFH-DA和MitoSOX Red染色发现，SC/F水凝胶能有效清除UVA引起的细胞内活性氧和线粒体活性氧水平升高。JC-1染色结果表明，SC/F水凝胶还能稳定因UVA照射而下降的线粒体膜电位，缓解线粒体功能紊乱，从而减轻氧化应激损伤。

3.5. SC/F水凝胶体外清除衰老细胞并抑制SASP

免疫荧光染色显示，SC/F水凝胶处理显著降低了UVA引起的DNA双链断裂标记物γH2A.X的焦点形成。细胞周期分析表明，SC/F水凝胶减少了停滞在G1期的细胞比例，增加了S期细胞比例，缓解了细胞衰老相关的周期阻滞。SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率在SC/F组明显下降。此外，RT-PCR结果显示，SC/F水凝胶显著抑制了衰老相关分泌表型因子IL-8、MMP1和MMP3的基因表达，表明其能有效抑制衰老细胞的促炎和基质降解活性。

3.6. SC/F-HMNs体内改善皱纹形成和皮肤弹性

在UVA诱导的光老化小鼠模型中，为期8周的SC/F-HMNs治疗显著改善了背部皮肤的外观，减少了皱纹的深度、数量和总面积，并提高了皮肤弹性。对主要器官的组织学和血清生化指标分析未发现明显毒性，证实了其体内应用的安全性。

3.7. SC/F-HMNs体内重塑真皮细胞外基质微环境

组织学分析表明，SC/F-HMNs治疗增加了光老化皮肤的真皮厚度和胶原纤维含量。通过TWOMBLI算法对Masson染色图像进行细胞外基质模式分析发现，SC/F-HMNs处理使胶原纤维的排列更有序，碎片化程度降低。天狼星红染色显示，SC/F-HMNs调节了胶原I/胶原III的比例。地衣红染色表明，SC/F-HMNs有助于维持弹性纤维的连续性。免疫组化结果显示，SC/F-HMNs显著降低了真皮中MMP1和MMP3的表达水平。

3.8. SC/F-HMNs体内减少氧化损伤和衰老成纤维细胞

免疫荧光染色显示，SC/F-HMNs治疗显著降低了光老化皮肤中脂质过氧化产物4-HNE和氧化性DNA损伤标记物8-OHdG的水平。同时，氧化应激关键调控因子Nrf2及其下游靶点HO-1的表达也被SC/F-HMNs有效抑制。共聚焦成像分析进一步证实，SC/F-HMNs减少了真皮中vimentin阳性的成纤维细胞中γH2A.X和p21的表达，表明其能减轻UVA引起的成纤维细胞DNA损伤和衰老。

3.9. SC/F-HMNs体内修复表皮屏障并恢复表皮稳态

H&E染色显示，SC/F-HMNs缓解了UVA引起的表皮增生性增厚。免疫荧光染色表明，SC/F-HMNs恢复了表皮水通道蛋白3的表达水平。无创皮肤测试证实，SC/F-HMNs治疗降低了经皮水分流失，提高了皮肤水合值。对表皮干细胞标志物CK19、基底细胞标志物CK5和分化角质形成细胞标志物CK10的染色分析显示，SC/F-HMNs有助于恢复UVA破坏的表皮细胞分层和稳态，减少表皮干细胞的过度分化。

本研究成功开发了一种集衰老细胞清除与屏障修复于一体的协同治疗平台。SC/F-HMNs通过高效透皮递送非瑟汀至真皮，选择性清除衰老的成纤维细胞，阻断其分泌的SASP对细胞外基质的破坏作用；同时，其所含的rhCol17有助于修复表皮屏障功能，维持表皮干细胞稳态，从而从源头上减少外部刺激对真皮微环境的二次伤害。这种“源头干预-屏障维持”的双模机制，不仅显著逆转了光老化皮肤的表型和分子特征，重塑了健康的真皮微环境，而且为治疗其他由氧化应激介导的皮肤疾病提供了新的思路和具有转化潜力的技术平台。