霍乱弧菌新型外膜蛋白的发现：AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM的生物物理学解析与表位预测为免疫治疗和疫苗设计提供新策略

本研究系统性探索了霍乱弧菌中五种关键外膜蛋白（OMPs）——AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM的结构重折叠策略与免疫原性表征。通过筛选高效去垢剂（如LDAO、DDM、POE）成功恢复β-桶状天然构象，并联合圆二色谱、荧光光谱及蛋白稳定性实验验证结构完整性。免疫信息学分析进一步揭示其表面可及环区存在优势B细胞与T细胞表位，为开发针对霍乱的亚单位疫苗和靶向免疫疗法提供了理论依据与实验基础。

　　

亮点

化学品

DNA聚合酶（Taq和Pfu）、dNTPs、琼脂糖、LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、PMSF和溶菌酶购自Himedia（印度）。去垢剂包括β-OG、DDM、LDAO、POE和Tween-20购自Sigma（印度）。镍氮三乙酸（Ni-NTA）磁珠来自Qiagen（德国）。

霍乱弧菌AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM的计算机分析

为确认这些蛋白中存在可插入外膜的区域，我们分析了它们的N端信号肽。SignalP 6.0预测AcfA信号肽为18个氨基酸（AA），Opa为20AA，VxrD为21AA，LamB为20AA，VpsM为27AA（图S1A）。通过ProtParam工具确定了这些OMPs的关键理化性质：AcfA由215个氨基酸组成，分子量为23.5 kDa，等电点（pI）为4.97；Opa含347个氨基酸，分子量为38.2 kDa，pI为9.24；VxrD有392个氨基酸，分子量为42.8 kDa，pI为8.77；LamB由421个氨基酸构成，分子量为47.1 kDa，pI为4.69；VpsM包含738个氨基酸，分子量为81.5 kDa，pI为5.01。所有蛋白均显示高疏水性（GRAVY值>0），印证了其作为β-桶状 transmembrane 蛋白的特性（表S1）。通过PRED-TMBB和TMBETA-GO预测了跨膜β-链，结果显示AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM分别具有16、14、16、18和22个预测跨膜链（图S1B-F）。

讨论

外膜蛋白AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM在霍乱弧菌致病机制中扮演关键角色，尽管其结构和功能在该菌中尚未被充分探索。AcfA参与感染进程，并在鱼模型中对溶藻弧菌感染展现出保护潜力，免疫后可引发强效持久的免疫应答。值得注意的是，AcfA还增强副溶血弧菌在高温和高盐胁迫下的耐受性。Opa蛋白因其多态性以及与宿主细胞的紧密黏附功能而广为人知，尤其在奈瑟菌中研究较多，但在弧菌中的类似作用尚待深入挖掘。VxrD作为Vxr操纵子的一部分，参与调控Ⅵ型分泌系统（T6SS）等膜相关毒力因子。LamB（麦芽糖孔蛋白）负责麦芽糖和麦芽糊精的摄取，对细菌在营养受限环境中的生存至关重要。VpsM则涉及VPS多糖组分的运输，对生物膜形成具有重要作用。

结论

外膜蛋白AcfA、Opa、VxrD、LamB和VpsM在霍乱弧菌的毒力中起到核心作用，因此对其结构和功能的解析尤为关键。为实现深入分析，我们成功从包涵体中过表达、纯化并重折叠了这些蛋白，系统评估了一系列去垢剂在恢复类天然构象方面的效能。值得注意的是，两性离子去垢剂LDAO和非离子去垢剂DDM、POE consistently表现出优异的辅助重折叠能力。