甲酸盐驱动级联催化体系实现惰性C(sp3)-H键氧功能化：Rh(III)配合物功能化分级共价有机框架固定化非特异性过氧合酶-CLEAs的创新设计

本研究针对非特异性过氧合酶(UPO)因外源H2O2导致氧化失活的关键问题，开发了甲酸盐驱动的化学酶级联系统。研究人员通过将RhIII配合物与非特异性过氧合酶共固定于分级共价有机框架(COF)，实现了原位H2O2生成与C(sp3)-H键氧功能化的高效耦合。该系统在温和条件下实现多种底物的手性羟基化，产率达99%，对映体过量值>99%，且催化剂循环6次后仍保持75.6%活性，为绿色合成提供了新范式。

　　

在合成化学领域，惰性C(sp³)-H键的选择性功能化一直是个重大挑战。传统方法依赖细胞色素P450单加氧酶(P450s)，但存在辅因子NADH消耗量大、电子传递途径复杂等问题。而非特异性过氧合酶(unspecific peroxygenases, UPOs)只需H₂O₂作为氧化剂即可实现类似P450s的催化机制，更具应用潜力。然而，UPOs在氧化条件下稳定性差，尤其过量H₂O₂会导致血红素失活，严重限制其实际应用。

为解决这一难题，河北工业大学研究团队在《Molecular Catalysis》发表了一项创新研究，他们开发了一种甲酸盐驱动的化学酶级联系统，成功实现了惰性C(sp³)-H键的高效氧功能化。该研究通过精巧的催化剂设计，将Rh(III)配合物与来自Agrocybe aegerita的非特异性过氧合酶(AaeUPO)共固定于分级多孔共价有机框架(COF)中，构建了多功能集成催化剂AaeUPO@Rh-macroCOF。

研究采用的关键技术包括：以聚苯乙烯微球为模板制备分级多孔COF载体；通过配位作用将[Cp*RhCl₂]₂固载到联吡啶功能化的macroCOF上；使用交联酶聚集体(CLEAs)技术固定化AaeUPO；通过ICP-OES、XPS、FT-IR、CLSM等多技术手段表征催化剂结构；采用碘化物比色法实时监测H₂O₂生成；通过手性HPLC分析对映选择性。

3.1. Preparation of AaeUPO@Rh-macroCOF

研究人员首先以单分散聚苯乙烯球(PSs)为模板制备了具有大孔和微孔的分级COF(macroCOF)，然后通过[Cp*RhCl₂]₂配位得到Rh功能化COF(Rh-macroCOF)，最后利用交联和沉淀法将毕赤酵母重组表达的AaeUPO固定于Rh-macroCOF，获得集成化学酶催化剂。

3.2. Characterization of Rh-macroCOF

FT-IR证实了共价有机框架的成功形成，PXRD显示macroCOF和Rh-macroCOF保持了母体TpBpy框架的晶体结构。氮气吸附-脱附等温线显示所有材料均保持介孔性，BET表面积从原始TpBpy的726 m²/g降至Rh-macroCOF的63 m²/g，证实了Rh配合物成功掺入框架通道。TEM显示Rh-macroCOF具有均匀的大孔结构，EDS mapping证实Rh物种在整个macroCOF框架中均匀分散。

3.3. H₂O₂ production over Rh-macroCOF

催化性能评估表明，Rh₄₀-macroCOF在H₂O₂生成中表现最佳，速率达839.8 μmol·g^-1·h^-1。动力学研究发现Rh₄₀-macroCOF具有最高的V_max/K_M比值。自由基捕获实验证实·O₂^-是主要中间体。底物特异性评估显示甲酸钠作为氢供体时性能最优，DFT计算表明甲酸与催化活性位点的结合能(-176.51 kcal/mol)远强于甲醇(-17.08 kcal/mol)。

3.4. Fabrication and characterization of integrated chemoenzymatic catalyst AaeUPO@Rh-macroCOF

通过系统优化固定化条件，AaeUPO@Rh-macroCOF的最高酶活性回收率达到28%。FT-IR、SEM、CLSM和XPS分析证实了酶在Rh-macroCOF上的成功固定化，且Rh物种的氧化态未受酶固定化影响，证明化学和酶模块在宏观COF框架内成功集成。

3.5. Chemoenzymatic oxyfunctionalization of inert C(sp³)-H bonds over AaeUPO@Rh-macroCOF

以乙苯(1s)转化为(R)-1-苯乙醇(1p)为模型反应，优化后的条件下达99%产率和>99% ee值。控制实验表明缺少任何单个元素(AaeUPO、Rh-macroCOF或甲酸盐)都会完全消除1s的氧功能化。与分离系统相比，集成催化剂表现出显著更高的催化性能，归因于 proximity effect。催化剂循环使用6次后仍保持75.6%的初始活性，显示良好的稳定性。

3.6. Stability study

稳定性研究表明，AaeUPO@Rh-macroCOF在pH、热和机械稳定性方面均显著优于游离AaeUPO和CLEAs-AaeUPO。在50°C加热6小时后仍保持83%以上初始酶活性，在500 rpm机械搅拌12天后也保持类似稳定性。底物范围评估显示多种芳香烷烃都能高效氧化为相应手性醇，产率75-99%，对映体过量93-99%。

该研究成功开发了一种甲酸盐驱动的化学酶级联系统，通过将AaeUPO固定于Rh^III功能化分级COF，解决了传统H₂O₂依赖性血红素过氧合酶的氧化失活问题。该系统利用O₂/甲酸盐原位生成H₂O₂，实现了顺序高效且可持续的酶促C-H键氧功能化。集成催化剂的构建不仅促进了化学和酶模块间的传质，还显著增强了AaeUPO的稳定性和可重复使用性。

研究的重要意义在于开发了一个自给自足的平台，通过H₂O₂的化学合成将其供应与酶失活解耦，为温和条件下的生物催化提供了通用策略。该工作桥接了合成化学与酶工程，推进了惰性键活化绿色方法学的发展。尽管在底物范围(特别是大体积和直链脂肪族底物)方面存在当前限制，但该系统为绿色合成应用提供了多功能平台，未来可通过机理阐明、工艺优化和生物相容性评估进一步拓展其应用潜力。