精子小RNA测序揭示miR-15b-5p、miR-19a-5p和miR-20a-5p作为男性生育力生物标志物及妊娠结局预测因子

本研究针对男性不育症诊断中传统精液参数评估的局限性，开展了基于单精子选择的小RNA测序研究。研究人员通过分析不同质量精子中miRNA和piRNA的表达谱，发现hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-19a-5p和hsa-miR-20a-5p的表达水平与精子活力、形态及IVF妊娠结局显著相关。这些小RNA分子可作为预测胚胎质量和活产率的潜在生物标志物（AUC值达0.71-0.76），为男性不育的分子诊断和辅助生殖预后评估提供了新思路。

在全球范围内，约有15%的夫妇面临不孕症的困扰，其中男性因素导致的不育约占40-50%。传统精液分析通过评估精子浓度、活力和形态等参数来诊断男性生育能力，但仍有大量被称为"特发性不育"的案例无法通过常规检测找到原因。随着表观遗传学研究的深入，科学家们发现精子不仅携带DNA遗传信息，还富含多种调控性RNA分子，包括microRNA（miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）等。这些小RNA在精子发生、受精和早期胚胎发育过程中扮演着重要调控角色，可能成为评估精子质量和预测生殖结局的新型分子标志物。

为了深入探索小RNA在男性生育力评估中的价值，研究人员在《Non-coding RNA Research》发表了这项创新性研究。该研究采用单精子选择技术结合高通量测序方法，系统分析了不同质量精子中小RNA的表达特征，并验证了其与临床生殖结局的关联性。

研究团队主要运用了以下关键技术：首先通过显微操作技术从98名男性参与者中分离单个精子，根据世界卫生组织（WHO）标准分为A组（正常活力与形态）、B组（无活力但形态正常）和C组（无活力且形态异常）；随后使用miRNeasy Micro Kit进行小RNA提取，采用MGIEasy Small RNA Library Prep Kit构建测序文库，在MGI BGISEQ-G400平台上进行小RNA测序；最后通过RT-qPCR在85例验证队列样本中对关键miRNA进行验证，使用Fluidigm Biomark HD系统进行高通量定量分析。

3.1. 筛查队列的人口学、激素和临床特征评估

对13对接受不孕治疗的夫妇进行分析发现，精子数量增加和前向运动能力提高与优质胚胎（G1级）显著相关。精子正常形态百分比在7-12%范围内与良好胚胎质量相关，而形态百分比降至3-5%则与不良结局相关。成功妊娠（β-hCG阳性）与精子前向运动力（10-30%）和正常形态（4-12%）密切相关，而与精子数量的直接关联不明显。激素分析显示，较低水平的FSH和LH与阳性妊娠结局相关。

3.2. 小RNA测序读段的处理和注释

对39个样本的小RNA测序分析显示，长链非编码RNA（lncRNA）是最丰富的RNA类型（72.69%），其次是核糖体RNA（rRNA，8.79%）和转运RNA（tRNA，3.97%）。piRNA占4.64%，而miRNA相对较少（0.70%）。值得注意的是，C组（质量最差）的piRNA含量最高（5.96%），而miRNA含量从A组的0.83%降至C组的0.66%。

3.3. 差异表达的miRNA和piRNA

比较分析发现，A组和C组之间存在16个显著差异表达的miRNA，其中14个下调、2个上调。hsa-miR-223-3p（log2FC = -5.19）、hsa-miR-424-5p（log2FC = -2.48）和hsa-miR-199a-5p（log2FC = -2.59）下调最为显著。piRNA分析鉴定出37个显著差异表达的piRNA，其中33个下调、4个上调。B组和C组比较仅发现6个差异表达的piRNA。

3.4. 差异表达miRNA与精子参数的相关性分析

Spearman相关分析显示，在A组中多个miRNA与精子参数显著相关。hsa-miR-15a-5p与前向运动力（PM）呈负相关（r = -0.575），与不动精子（IM）呈正相关（r = 0.725）。hsa-miR-15b-5p和hsa-miR-16-5p也显示类似趋势，表明这些miRNA可能参与精子运动功能的调控。

3.5. 差异表达piRNA与精子参数的相关性分析

piRNA与精子参数的相关性模式与miRNA相似。piR-28773、piR-17540和piR-25779与前向运动力呈显著负相关，而与不动精子比例呈正相关，提示piRNA在精子功能调控中同样发挥重要作用。

3.6. 使用实时RT-qPCR分析验证miRNA

3.6.1. 验证队列的人口学、激素和临床特征评估

对85名男性的验证分析证实了筛查队列的发现，精子数量、运动力和形态与胚胎质量等级显著相关。G1胚胎相关的精子样本显示出更高的运动力和形态正常率。

3.6.2. 年龄和精子条件无关的miRNA表达分析

相关性分析表明，所有测试miRNA的表达水平与年龄无显著关联（r < 0.1），排除了年龄因素对miRNA表达的 confounding影响。

3.6.3. miRNA表达水平与基本精液参数的相关性

验证队列中，hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-19a-5p和hsa-miR-20a-5p与精子数量、前向运动力和形态均呈显著负相关，与不动精子比例呈正相关，证实了这些miRNA作为精子质量标志物的潜力。

3.6.4. miRNA表达水平与FSH、LH、胚胎质量和β-hCG/活产率的关系

这些miRNA与FSH和LH水平呈弱正相关，在β-hCG阴性组中表达显著升高。在胚胎分级分析中，G1胚胎的这些miRNA表达水平低于G2胚胎。最重要的是，在IVF失败周期中，这三种miRNA的表达水平显著高于成功活产组。

3.6.5. 选定miRNA的诊断意义

ROC曲线分析显示，hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-19a-5p和hsa-miR-20a-5p对区分IVF成功与失败的AUC值分别为0.76、0.71和0.74。三者组合的模型AUC达到0.75，表明这些miRNA具有显著的诊断价值。

研究结论表明，精子中小RNA特别是miRNA和piRNA的表达模式与精子质量和生殖结局密切相关。hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-19a-5p和hsa-miR-20a-5p的高表达与精子参数异常和IVF失败显著相关，使其成为评估男性生育力和预测辅助生殖成功的潜在生物标志物。

这项研究的重要意义在于首次系统性地将单精子选择技术与小RNA测序相结合，揭示了精子RNA组与生殖结局的密切关联。研究发现的特异性miRNA标志物不仅为男性不育的诊断提供了新方法，还为改善辅助生殖技术的胚胎选择策略提供了分子依据。未来通过开发基于这些miRNA的临床检测 panel，可能实现更精准的不育症诊断和个性化治疗策略制定，最终提高辅助生殖技术的成功率。