整合空间与化学信息增强拉曼成像对非酒精性脂肪性肝炎状态的分辨能力

本研究开发了一种整合空间与化学信息的信息理论方法，用于分析生物样本的拉曼图像。该方法通过量化每个像素点周围光谱的空间异质性（spatial heterogeneity），结合信息瓶颈（information bottleneck）聚类算法，成功区分了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠模型中正常、非酒精性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的肝组织状态。研究结果表明，引入空间信息可进一步识别出仅凭光谱相似性无法区分的亚状态，例如NASH组织中与疾病进展和血液污染相关的细微差异，为无标记病理诊断提供了新视角。

　　

引言

拉曼成像技术能够在无需标记的情况下，同时获取生物样本的化学组成和空间分布信息，在生物医学应用中具有显著潜力。该技术通过测量每个像素点的拉曼光谱，构建由二维空间位置和拉曼位移组成的数据结构，从而包含丰富的化学信息。近年来，拉曼显微镜的进展使得在亚细胞、体外和离体组织成像中获取丰富信息成为可能。由于生物样本的光谱差异往往较为细微，化学计量学在多个方面辅助其应用，包括k近邻、判别分析、支持向量机、神经网络和模糊聚类等分类模型。然而，这些机器学习方法主要关注化学信息，很少考虑空间信息，即将拉曼图像视为拉曼光谱的集合，忽略了光谱在视场（FOV）中空间组装的结构。细胞和组织中的化学物种表现出空间异质性的结构和模式，这种空间结构在病理学中尤其重要，例如在染色图像中观察细胞质、细胞核和组织的空间对比。利用拉曼信号的空间信息以及化学信息，还可以通过选择性照明加速测量。此外，大多数生物样本的病理检查都与形态特征相关。例如，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特征是在无明显酒精消耗的情况下，肝脏中异常脂质积累超过5%，通过病理学家在染色图像上观察肝细胞炎症、气球样变和纤维化等空间结构，病理学上分为非酒精性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NAFL通常具有稳定且非进展性的病程，肝细胞中存在脂滴；而NASH则与不良预后和进展为肝硬化或肝癌的风险相关。最近的研究表明NAFLD的进展更为复杂和多样化，关于快速进展为晚期纤维化和NASH伴肝硬化的研究也有所进展。尽管其他高光谱成像技术（如近红外光谱）为生物成像提供了强大能力，自发拉曼散射显微镜在本研究中具有独特优势：从富水组织非侵入性收集光谱、广泛的光谱覆盖以捕获化学空间多样性、高灵敏度检测生物分子（包括细胞色素和维生素A， facilitated by resonance Raman effects），以及无需样本染色的优势。

本研究提出了一种基于信息理论的方法，通过引入辅助变量来分类生物样本的拉曼图像，该变量量化了光谱的空间异质性，即相邻像素点的拉曼光谱反映微观化学状态的差异程度。我们分析了从NAFLD大鼠模型解剖的肝组织，这些组织被病理学分类为正常、NAFL和NASH。我们探讨了在化学信息基础上增加空间信息如何进一步区分组织状态，特别是在NASH样本中。在下文中，我们将结合光谱信息和空间位置信息称为化学空间信息（chemo-spatial information）。

结果

拉曼图像中的空间异质性

空间异质性基于每个像素点与其周围像素点之间的拉曼光谱距离定义。围绕像素点r的周围像素点集合定义为以r为中心、半径为λ₀的圆内的像素点，记为S_r。本研究采用λ₀=20 μm（约4个像素）作为典型空间尺度，略大于肝细胞的典型尺寸，使得化学空间信息与肝细胞尺度上的拉曼信号空间多样性相关。对于给定的中心像素点r和其周围像素点s ∈ S_r，光谱距离v(I_r, I_s)定义为所有测量波数w ∈ W的拉曼强度绝对差之和。对于任何给定像素点r，存在一组不同的v值，这提供了光谱距离的条件概率分布p(V=v|R=r)，作为量化拉曼图像空间异质性的描述符。该空间异质性反映了在半径λ₀定义的空间尺度内拉曼图像的空间结构。概率分布函数（PDFs）p_V|R(v|r)和p_V|R(v|r')的示例表明，前者具有较大的方差和长尾，反映了像素点r附近的异质化学空间信息；后者具有较小的方差和尖锐峰值，反映了像素点r'附近的同质局部化学空间信息。拉曼光谱空间位置的随机打乱会完全改变p_V|R的分布，但不影响常用聚类分析的结果，因为它们不考虑图像中的任何空间信息。

使用信息瓶颈方法，基于概率分布函数p_V|R作为描述符进行聚类。聚类中，总聚类数设置为4（我们确认对于聚类数3-6，以下结论不变）。聚类方法的详细信息在方法部分提供。

NAFLD模型肝组织拉曼图像的化学空间聚类

我们将化学空间聚类方法应用于NAFLD模型肝组织的拉曼图像。总共48只大鼠被饲养于不同饮食条件下：标准饮食（SD，16只）、高脂饮食（HFD，60%猪油，16只）和高脂高胆固醇饮食（HFHC，60%猪油，1.25%胆固醇，0.5%胆酸，16只）。每组在2、4、8和16周（开始指定喂养后）处死4只大鼠以收集样本。对每只处死大鼠的切片肝组织进行拉曼成像。NAFLD肝组织的拉曼图像使用先前已知协议进行预处理。

图2a显示了光谱距离的条件概率分布p_V|C(v|c)，代表了属于聚类c的像素点的化学异质性。聚类索引从1到4按化学异质性递减顺序排列，因此索引越大，像素点附近的拉曼光谱差异越小（即更同质）。图2b显示了每个大鼠肝组织样本的聚类空间分布（称为聚类图），根据饮食条件SD、HFD和HFHC分类。病理识别的组织状态（正常、NAFL和NASH）分别由细黑框、粗粉框和粗蓝框表示。作为NAFLD化学空间分析的整体趋势，最严重的疾病组织NASH表现出化学空间同质模式（参见绿色连续区域，是最化学同质的聚类）。有趣的是，并非所有，但一些来自HFHC饮食模型的NAFL组织也表现出与NASH相似的化学同质性（例如HFHC4w2和HFHC8w2）。就饮食模型类别而言，聚类3（蓝色）分布在SD和HFD组织的图像上，其中更化学空间异质的聚类2（黄色）和1（橙色）稀疏分布。反过来，HFHC图像似乎大致分为两类，就化学空间同质聚类4的丰度而言，不一定与病理识别的NAFL和NASH类别对应。即，HFHC4w1、HFHC4w2、HFHC8w2和大多数HFHC16w图像（除HFHC16w4外）的聚类4种群高度丰富。应注意，这种跨饮食和病理识别状态的化学空间异质性独特模式无法通过仅基于拉曼光谱特征的标准聚类捕获。

基于化学信息的聚类分析

为了探究实际影响空间中化学异质性的化学物种，我们将当前结果与仅基于相同视场（FOV）中拉曼光谱信息的聚类分析进行比较。这里inafter，我们称此为化学聚类，而前者考虑拉曼信号中化学空间异质性的聚类称为化学空间聚类。图3a展示了化学聚类分析的结果，其中识别出七个不同的光谱聚类。请注意，化学聚类中的聚类差异分辨率高于化学空间聚类。从聚类1′到7′，脂肪积累增加（参见脂质2790-3045 cm^-1的高波数区域），而维生素A减少（1595 cm^-1）。图3b显示了每个图像中聚类的空间分布。这些表明维生素A在正常组织中的定位，而一些具有HFHC饮食的NAFL（称为NAFL-β）和NASH似乎表现出广泛的脂肪积累范围。应注意，即使拉曼信号的空间信息通过像素间随机打乱完全破坏，这种标准化学聚类分析中的聚类大小（即种群）也完全保留。与图2b相比，似乎存在部分相似模式，例如化学聚类中聚类7′（灰色）（～脂质丰富，维生素A和细胞色素较少）的空间模式与化学空间聚类中聚类4（绿色）（～最同质）的空间模式在HFHD饮食模型中相似。

化学空间聚类与化学聚类的联合概率分析

为了量化化学空间聚类和化学聚类结果之间的相互关系，我们检查了两种聚类类型的联合概率分布p_C,C′(c,c′)，即像素同时属于化学空间聚类的第c个聚类和化学聚类的第c′个聚类的概率。如图4a所示，对于HFHC4w2（NAFL）和HFHC8w2（NAFL）的聚类图（第一行：化学空间聚类，第二行：化学聚类），例如，所选两个像素同时属于化学空间聚类的聚类4（即C=4）和化学聚类的聚类7′（即C′=7′），并计入此类像素的总数N(C=4,C′=7′)中。联合概率分布通过p_C,C′(c,c′)=N(C=c,C′=c′)/N_pixel计算。图4a中最左边的图显示了联合概率分布p_C,C′(c,c′)的热图，其统计是在所有肝组织拉曼图像上进行的，以窥见两种聚类方案之间的整体关系。水平和垂直轴分别对应无空间结构的化学聚类和化学空间聚类的聚类索引。化学空间聚类中聚类3的概率最高，化学聚类中聚类4′的概率最大（参见图4a中的边缘概率分布P_C(c)和P_C′(c′)）。非常粗略地，相对高的联合概率在热图上似乎呈对角线排列作为整体趋势：化学空间聚类中聚类索引增加越多[即空间上更同质（图2a）]，化学聚类中聚类索引增加越多[即更多脂质，更少维生素A和细胞色素含量（图3a）]。这可能与图2b和图3b作为整体趋势看起来相似的事实相符。

然而，当联合概率仅在相同病理状态和相同饮食的肝组织集合上计算时，联合概率的模式变得更加多样化（图4b）。例如，（饮食，病理状态）=（HFD，NAFL）对应被喂食高脂饮食相对较长时间（4、8、16周）并被病理识别为NAFL的大鼠肝组织集合。同样，（HFHC，NAFL）对应被喂食高脂高胆固醇饮食（例如2、4、8周）并被病理识别为NAFL的集合。作为整体趋势，从（SD，正常）→（HFD，正常）→（HFD，NAFL）→（HFHC，NAFL）→（HFHC，NASH），化学空间聚类中最主要的聚类C从聚类3转移到4，化学聚类中最主要的聚类C′从聚类4′转移到7′。这表明随着NAFLD进展，肝组织中脂质增加但维生素A和细胞色素减少，同时其局部化学环境在肝细胞典型空间尺度内变得更加同质。

图4b的第一个显著结果是，在相同疾病状态病理识别为NAFL但不同饮食模型（HFD和HFHC）下，（HFHC，NAFL）的联合概率分布p_C,C′(c,c′)看起来比（HFD，NAFL）更接近（HFHC，NASH），表明（HFHC，NAFL）的肝组织类似于（HFHC，NASH）的肝组织。这表明在NASH形态特征出现之前，拉曼成像有潜力在NAFL中推断接近NASH（即不良预后）的情况，不仅化学上而且化学空间上。同样，当比较相同病理状态“正常”的（SD，正常）和（HFD，正常）时，它们的联合概率分布不一定相似。对于两者，化学空间聚类中最主要的聚类是聚类3，这可能表明局部化学环境的异质性没有太大变化，但化学成分发生了变化（最主要聚类从聚类4′变为聚类5′）。

图像级分析：NAFL与NASH的深入观察

让我们更深入地观察图像级分析，特别是病理识别为NAFL和NASH的肝组织拉曼图像，因为NAFL是向NASH转变的“驱动者”。在图5中，并列两种不同类型的聚类图（化学空间和化学聚类），以及每个图像的热图联合概率分布p_C,C′(c,c′)及其边缘分布P_C(c)和P_C′(c′)附加在垂直和水平方向。比较喂食HFHC饮食16周（HFHC16w）的大鼠每个图像的热图——预期为最严重 condition with the state of NASH — 与整体（HFHC，NASH）热图（图4b）表明，HFHC16w1、HFHC16w2和HFHC16w3的图像遵循HFHC-NASH热图的一般特征。在化学空间聚类中，HFHC16w1、HFHC16w2和HFHC16w3的光谱主要属于聚类4，同时属于聚类7′，表明以更多脂质和更少维生素A和细胞色素为特征的化学环境在 large spatial region 同质地分布。

化学空间聚类的第二个显著结果如下：在HFHC16w大鼠模型中，第四个个体（表示为HFHC16w4）偏离了化学空间聚类中最主要的平均特征：与其他HFHC16w模型不同，许多光谱属于聚类1到3，而不是主要属于聚类4。这与化学聚类的情况相反，在化学聚类中，HFHC16w4的拉曼光谱主要属于聚类7′，就像其他HFHC16w模型一样。这与我们对化学和化学空间聚类两种类型聚类图的视觉检查一致。尽管拉曼光谱表明脂质丰富，维生素A和细胞色素较少（来自聚类7′的主导），但化学成分在组织中的分布模式与平均拉曼特征不同。请注意，HFHC16w4与其他HFHC16w模型之间的区别在使用化学聚类时并未显现，因为它不考虑拉曼信号的空间结构，并且化学聚类的聚类图视觉检查似乎未显示伴随主要聚类6′和7′的HFHC16w模型之间存在显著差异。

空间异质性增加的起源

最后，我们探讨为什么在HFHC16w4中相似光谱分布的区域内空间异质性增加。为了考虑空间异质性增加的起源，显示了HFHC16w4在化学空间（图6a）和化学聚类（图6b）中的聚类图，以及由白圈指示的4像素半径（～肝细胞典型尺寸）的区域，该区域由相似光谱（聚类7′）组成，但在空间上相对异质。用于计算空间异质性的白圈区域内的拉曼光谱显示在图6c中（参见HFHC16w1区域中相应的拉曼光谱，如图S2所示，其中两种聚类方法呈现均匀分布，主要由单个聚类组成）。

图6c和图S2c的比较表明，在HFHC16w4模型的拉曼光谱中可能存在三个 distinct features。第一个特征是血液成分（血红蛋白）的相对高强度波动。在图6c中， several peaks are assigned to specific vibration modes of heme b and c, or both, such as 750, 1127, 1360, 1550, 1585, and 1635 cm^-1。在这些实验条件下， heme b 主要归因于血液中的血红蛋白， heme c 归因于细胞色素c。在上述归因于 heme 的峰中，1360和1550 cm^-1在 heme b 中通常比在 heme c 中更强烈，1635 cm^-1仅归因于 heme b（氧合）。在图6c中，这三个峰的强度在光谱中彼此相关。在本研究中，我们无法澄清血红蛋白的来源，但最合理的 scenario 是组织切除和切片步骤中的血液残留。本研究使用新鲜切除的肝脏样本：从切除区域逸出的红细胞的影响不能完全排除。这一解释也得到HFHC16w4中 compared to HFHC16w1 存在更大量氧合血红蛋白（1635 cm^-1）的结果支持。

第二个是相对丰富的维生素A的存在。具有归因于维生素A的1015、1160、1200、1275和1595 cm^-1峰值的光谱存在于局部区域内。如在HFHC16w1模型中，很少测量到反映维生素A的光谱。维生素A已知在正常条件下 localized in fat droplets，其减少已知发生在 several types of disease, including fatty liver。因此， abundant vitamin A的存在表明，与HFHC16w1相比，HFHC16w4的病理仍在进展中。第三个特征是脂肪区域内拉曼强度的大波动。HFHC16w4中白圈指示的区域——化学聚类提供几乎单个聚类，尽管化学空间聚类指示空间异质——比HFHC16w1中的脂肪波动更高。

为了确认上述讨论是否适用于HFHC16w家族中的所有像素，图7展示了化学空间异质性与其拉曼强度在血红蛋白相关、维生素A和脂质 across that family 的关系。图7a展示了在1130 cm^-1、1360 cm^-1、1550 cm^-1、1635 cm^-1（全部血红蛋白相关）、维生素A在1595 cm^-1和脂质在2856 cm^-1的拉曼强度热图，分别通过Amide-I拉曼位移标准化，以及化学空间聚类和化学聚类生成的HFHC16w家族的聚类图在图7b中。可以看到，不仅在白圈区域，而且在HFHC16w4热图的其他区域，血红蛋白相关成分比其他HFHC16w家族更 observed（即， across the hemoglobin-related HFHC16w4图像， reddish pixels更丰富）。例如，在HFHC16w2和HFHC16w3中，1550 cm^-1的血红蛋白成分稀疏分布（由图7a中的黑圈和黑箭头指示）。化学聚类（总聚类数七）无法区分 such sparsely distributed minor components。具体而言，化学空间聚类将HFHC16w3右黑圈内的血红蛋白相关次要成分识别为属于聚类2（黄色）（即，比其邻居的聚类4（绿色）更异质），而化学聚类不区分。同样，化学空间聚类将HFHC16w2黑圈内的次要成分区分为属于聚类2（黄色）（即，比其邻居的聚类3（浅蓝）和4（绿色）更异质），而化学聚类不将它们与邻居区分，并将它们分配为属于聚类6′，与细胞色素丰富（1130 cm^-1）区域相似。

为了进一步量化两种聚类方案的预测性能并解决化学空间聚类的局限性，我们合成了一组拉曼图像，其中化学污染 artificially added to the Raman images of HFHC8w2 and SD16w3 as representatives of relatively homogeneous and heterogeneous chemical environments, respectively, and evaluated to what degree chemo-spatial clustering and chemical clustering can predict chemical contamination。详细分析结果在支持信息第4节中呈现。在分析中，胆固醇（ respectively. polystyrene）被随机引入整个图像10%的像素，具有 several mixing ratios, e.g., mixing ratio 20:80 means that the original Raman spectrum located in the chosen pixel is contaminated 20% by cholesterol（ respectively. polystyrene）（图S3）。化学污染前后两种聚类方案的聚类结果之间的偏差显示在图S4至S7中，以及相应的F-measures分析关于预测哪些像素被化学污染使用每个像素聚类索引的变化（图S8）。例如，我们发现随着污染混合比例增加，F-measures在两种聚类中增加，并且化学空间聚类在更化学同质的环境中产生更高的F-measures，尽管没有 such systematic trend and the F-measures are relatively low in chemical clustering。然而，对于化学空间聚类，污染在更异质的环境中更难定位。总体而言，化学空间聚类是对传统化学聚类的补充，它考虑了样本中拉曼信号的空间信息，并且对化学污染更敏感。

结论与展望

我们开发了一种考虑化学空间信息的信息理论聚类方法， without compromising the structure of hyperspectral images。我们引入了空间异质性度量来量化空间中的局部化学异质性，并对其进行聚类。在NAFLD疾病大鼠模型中，我们证明了某些化学物种的增加和减少以及局部化学环境的同质化同时发生。一些NAFL组织也表现出与NASH相似的周围化学环境。这一特征在NAFL中从形态学观察中并不明显。此外，这种化学空间聚类在一些NASH组织中揭示了空间异质性血液沉积的存在，这些无法通过化学聚类轻松表征。

2023年6月，NAFLD和NASH分别更名为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）。这一命名变化涉及对诊断标准的审查，重点关注代谢异常和疾病的全面理解，包括那些饮用少量酒精的人。然而，MASLD/MASH和NAFLD/NASH在概念上相似，因此本研究 derived from the NAFLD/NASH model 的发现可能适用于更新的概念。

由于组织病理学利用染色图像中的组织形态信息，参考拉曼图像的空间结构以及化学成分是自然的。在本研究中，我们将空间异质性范围设置在半径λ₀=20 μm，对应肝细胞的典型尺寸。增加半径反映了空间中更大的化学环境，而空间异质性度量中每个像素之间的差异预计会减少，因为以单个像素为中心的区域 larger overlap。相反，减小半径可能诱导与亚细胞和细胞结构无关的更大波动。未来研究的主题之一应该是分类性能对局部区域大小的依赖性， within which chemical heterogeneity in physical space is characterized。

在本文中，我们使用信息瓶颈方法将每个像素的空间异质性分布p_V|R分组。该方法防止整个数据集R被划分为每个组超过实验误差。例如，聚类C应捕获关于目标数据V的较少详细信息，而不是像素数据R，因为聚类表示C仅保留R中像素细节的简化或“粗粒度版本”。由于固有的实验变异，R捕获关于V的信息程度在不同实验实例之间可能波动。同时，随着聚类数增加，C倾向于捕获更多关于V的信息。因此，如果当前设置中C保留的信息超过某些（假设的）实验实例中R保留的信息，那么建议减少聚类数，因为当前C捕获了关于V的过多详细信息。

所提出的方法可能有助于检测收集的组织样本中具有特定几何形状的外来物体，例如石棉或微塑料。例如，已知各种类型的石棉可以通过拉曼显微镜在生物组织中被区分。然而，检测它们的拉曼光谱需要相对较高的激发能量（如激光曝光时间几百秒），因此通过自发拉曼成像全面检测它们在组织中的分布一直受到技术限制。该方法的一个优势是通过检测化学成分和空间分布的差异来提高特定目标的检测灵敏度。这可能使得即使在目标拉曼光谱较弱或模式未知的条件下，也能在生物组织中检测到此类外来物体。

最后，我们阐述我们的信息理论方法与拉曼图像分析的深度学习（DL）方法的差异。当拉曼图像作为输入数据输入DL时，原则上，任何化学和化学空间信息都会以更抽象、黑盒方式被考虑，如果空间信息 also versatile to differentiate the disease states of the sample using the Raman images。然而，这面临信息泄漏问题，其中DL可以使用与样本无关的信息，例如（不明显的）实验条件涉及不均匀照射 profiles。尽管存在此问题，当适当的拉曼图像预处理可以进行时，DL可能是解决化学和化学空间信息以区分样本状态的另一种手段。

方法

信息瓶颈方法

我们使用信息瓶颈方法根据空间异质性p_V|R执行聚类。信息瓶颈方法计算像素点r属于类别（或聚类）c的概率，记为p_C|R(c|r)，通过解决以下变分问题：最小化p_C|R (I(C;R)-βI(C;V))。这里，大写C和R表示代表类别和像素的随机变量。I(C;R)是类别和像素数据之间的互信息，衡量聚类结果中保留了多少原始数据的信息。反过来，I(C;V)是类别和空间异质性数据之间的互信息，表明空间异质性信息在聚类结果中保留了多少。再次，大写V表示空间异质性的随机变量。上述变分问题的目标函数表示在最大化数据压缩（即较小的I(C;R)更多压缩或统一像素数据）和最大化空间异质性信息保留（即较大的I(C;V)更多保留空间异质性细节，需要更多聚类数）之间的权衡，其中参数β(>0)控制两个量之间的权衡。

方程(2)的形式解由p_C|R(c|r)=p_C(c)/Z(r,β) e^{-βD_KL[p_V|R(v|r)∥p_V|C(v|c)]}给出，其中Z(r,β)是归一化常数，符号D_KL表示Kullback-Leibler散度，衡量两个概率分布之间的“距离”。总之，随着D_KL减小——随着r处的空间异质性 profile（即p_V|R(v|r)）和类别c的代表性 profile（即p_V|C(v|c)）变得 closer，概率p_C|R(c|r)增加更多。换句话说，信息瓶颈方法基于空间异质性 characterized by p_V|R的相似性对拉曼图像中的每个像素进行分类。

在本研究中，超参数β控制数据压缩和保留之间的权衡，设置为850以确保 resulting clustering corresponds to a hard clustering——即，每个像素的聚类归属概率p_C|R(c|r)对于单个聚类接近1，对于所有其他聚类接近0。该参数选择也 adopted in Ref.。总聚类数设置为4（我们确认对于聚类数3-6，本文结论不变）。

模型动物、样本制备和测量条件

本研究根据ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南2.0执行和描述。动物模型根据以下 established protocols with minor modifications制备。8周龄雄性Slc: Sprague Dawley大鼠（Shimizu Laboratory Supplies, Kyoto, Japan）在12小时光暗循环中饲养，自由获取食物和水。如最近报道，48只大鼠分为三组接受不同饮食：标准饮食（SD）、高脂饮食（HFD, 60%猪油）和高脂高胆固醇饮食（HFHC, 60%猪油, 1.25%胆固醇, 0.5%胆酸）。所有饮食购自Oriental Yeast Co., Ltd.（Tokyo, Japan）。每组在2、4、8和16周（开始指定喂养后）处死4只大鼠以收集样本。样本收集时大鼠的重量（平均值±标准差）以克（g）为单位，4周喂养为409.0±21.9（SD）、430.2±27.7（HFD）、401±27.9（HFHC），8周喂养为472.5±35.5（SD）、510.3±42.1（HFD）、529.5±49.0（HFHC），16周喂养为563.3±33.3（SD）、681.3±47.5（HFD）、633.8±43.1