固氮蓝藻Crocosphaera亚热带种ATCC 51142光暗周期下代谢适应的蛋白质组学分析揭示生物固氮与光合作用协同调控新机制

为解决单细胞蓝藻如何协调固氮与光合作用这一难题，研究人员开展光暗周期和氮可用性条件下的蛋白质组学研究，发现氮酶复合体（NifHDK）、氢化酶（HupSL）和呼吸酶（CoxB1）在黑暗期协同表达，细胞通过氧化戊糖磷酸途径（OPP）和2-氧戊二酸（2-OG）代谢产生ATP支持生物固氮（BNF），为蓝藻生物能源应用提供新见解。

　　

在浩瀚的海洋生态系统中，有一类微小的光合微生物扮演着至关重要的角色——它们不仅能通过光合作用固定二氧化碳（CO₂），还能将大气中的氮气（N₂）转化为生物可利用的氮源，这些神奇的微生物就是固氮蓝藻。其中，Crocosphaera subtropica ATCC 51142（以下简称Crocosphaera 51142）作为一种单细胞固氮蓝藻，因其独特的能力在12小时光暗循环条件下进行生物固氮（BNF）而成为研究热点。然而，一个长期存在的科学难题是：蓝藻如何在同一细胞内协调两个看似矛盾的过程——产氧的光合作用和厌氧的固氮作用？

由于固氮酶对氧气高度敏感，蓝藻必须发展出精细的调控机制来保护固氮酶免受氧损伤。先前研究表明，Crocosphaera 51142主要通过将固氮过程限制在黑暗期来实现这种时空分离，但这一过程的蛋白质组水平动态变化和代谢网络调控尚未得到系统解析。为了深入理解这一机制，由Punyatoya Panda和Uma K. Aryal等研究人员组成的团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，通过定量蛋白质组学方法揭示了这种蓝藻在光暗周期和不同氮条件下的代谢适应策略。

研究人员主要采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对四种处理条件下的样品进行分析：固氮条件下黑暗期（D-）、固氮条件下光期（L-）、硝酸盐条件下黑暗期（D+）和硝酸盐条件下光期（L+）。样品来自实验室培养的Crocosphaera 51142菌株，在严格控制的光暗周期和氮条件下培养后，于光暗周期6小时点采集细胞进行蛋白质组分析。通过高分辨率质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos）和MaxQuant软件进行数据采集和处理，结合基因本体（GO）功能注释和生物信息学分析，系统揭示了蛋白质表达动态变化。

概述蛋白质组结果

研究共鉴定到2,050个高置信度蛋白质，约占该蓝藻蛋白质组的40%。主成分分析（PCA）显示生物学重复间具有高度一致性。方差分析表明，1,370个蛋白质受硝酸盐可用性显著影响，557个受光暗周期调节，361个受两者交互作用影响。在固氮条件下的黑暗期检测到的蛋白质数量最多，表明细胞在此期间代谢活动最为活跃。

呼吸和糖原代谢相关蛋白质的差异调节

研究发现呼吸酶细胞色素c氧化酶亚基CoxB1（cce_1977）在固氮条件下显著上调，在黑暗期增加13倍，在光期增加3.8倍，其表达与固氮酶活性密切相关。糖原代谢酶也呈现明显的光暗调节模式：糖原合成酶GlgA1和GlgA2在光期更丰富，而糖原磷酸化酶GlgP1和GlgP2在黑暗期更丰富。这种调节模式表明糖原在光期积累，在黑暗期降解为固氮过程提供能量和还原力。

糖酵解、三羧酸循环和氧化戊糖磷酸途径酶的调节

糖酵解酶的表达水平在光暗周期间保持稳定，但对氮可用性表现出强烈响应。氧化戊糖磷酸（OPP）途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf（cce_2536）在固氮黑暗期上调，该酶负责产生固氮所需的NADPH。其他OPP途径酶如Gnd、OpcA、TalA、TalC和Pgl在固氮黑暗期也显示较高丰度。三羧酸循环（TCA）酶在黑暗期普遍更丰富，特别是在氮可用性条件下，其中异柠檬酸脱氢酶Icd（cce_3202）在固氮生长中显著上调。

氮酶和氢化酶酶簇的表达

研究鉴定到14个注释的氮酶相关蛋白质，全部在固氮条件下差异表达且在非固氮条件下完全不表达。所有氮酶在固氮生长下的光期和黑暗期都存在，但黑暗期的丰度显著更高，变化范围从NifN的7倍到NifH的450倍。结构蛋白NifHDK是最上调的，其次是NifT（cce_0547）和NifW（cce_0568）。2Fe-2S putative固氮相关蛋白（cce_0571）在固氮黑暗期比硝酸盐条件下高134倍。

摄取氢化酶HupSL复合物在黑暗期固氮生长下诱导表达，HupL丰度提高76倍，HupS提高8倍。该酶负责回收固氮酶产生的分子氢（H₂），将其转化为质子和电子用于ATP生产或其他还原反应。

光合作用和二氧化碳固定

研究发现与光合系统I（PSI）和光合系统II（PSII）相关的蛋白质在黑暗期相比光期下调，在缺氮条件下进一步下调。Crocosphaera 51142中有4个PsbA拷贝，每个在不同条件下受到不同调节。PsbA3（cce_0267）是所有条件下主要的PsbA物种，在硝酸盐存在下比缺氮条件下高约2倍。PsbA1（和PsbA5）在固氮条件下增加最多（约8倍），但仍比PsbA3浓度低约5倍。PsbA4是丰度最低的PsbA物种，但在硝酸盐存在下的黑暗期上调。

蛋白质翻译、折叠、降解和细胞稳态

大多数鉴定的30S和50S核糖体蛋白质在固氮条件下下调。分子伴侣和热休克蛋白在固氮条件下表达增加，如小热休克蛋白HSP20（HspA3；cce_5270）在黑暗期增加3.5倍，在光期增加3.0倍；伴侣蛋白DnaK2（cce_4004）在黑暗期增加7.5倍以上，在光期增加4.5倍以上。

研究鉴定了多种蛋白酶，包括ATP依赖性Clp蛋白酶（ClpX、ClpP、ClpP2、ClpP4、ClpC1）、ATP依赖性锌金属蛋白酶（Ftsh、FtsH2、FtsH4）和CAAX-及羧基末端蛋白酶（CtpA、CtpB）。这些蛋白酶在固氮条件下的丰度普遍高于非固氮条件，表明它们在固氮过程中蛋白质稳态维持中起关键作用。

转录与蛋白质表达比较

研究人员将蛋白质组数据与已发表的转录组数据进行比较，发现转录本在黑暗周期早期（1小时和5小时）与6小时蛋白质数据之间存在强相关性，但9小时转录本与蛋白质数据无相关性。固氮蛋白质的转录本和蛋白质水平在所有时间点都显示出高度相关性，表明固氮酶表达受到严格调控。

研究结论表明，Crocosphaera 51142通过精细调控蛋白质表达来实现光合作用和固氮作用的时空分离。在黑暗期，细胞通过上调呼吸酶（如CoxB1）和糖原降解酶（如GlgP1）来维持低氧环境，同时大量表达固氮酶复合物（NifHDK）和氢化酶（HupSL）进行生物固氮。这些过程受到 circadian clock 蛋白（KaiA、KaiC1、KaiC2）的调节，形成协调的代谢网络。

该研究的重要意义在于首次在蛋白质组水平系统揭示了单细胞固氮蓝藻在光暗周期下的代谢适应策略，发现了固氮酶表达的空前动态范围（7-450倍变化），为理解蓝藻固氮机制提供了全新见解。这些发现不仅有助于理解海洋氮循环的微观机制，也为开发蓝藻为基础的生物能源生产（如氢能源）和农业固氮应用提供了重要理论基础。研究揭示的代谢调控网络和关键酶靶点可为合成生物学改造蓝藻提供指导，实现更高效的碳捕获和氮固定，对应对全球气候变化和粮食安全挑战具有潜在应用价值。