综述：用于增强CRISPR诊断的先进核酸探针

本综述系统探讨了高阶核酸探针（如发夹结构、G-三链体（G3）和G-四链体（G4））在CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）诊断中的应用。文章详细分析了这些探针如何通过提升信号稳定性、错配辨别力和免扩增灵敏度，显著增强Cas12/Cas13系统的检测性能，为开发高稳健性、高特异性的即时检测（POCT）技术提供了新方向。

　　

General mechanisms of CRISPR-Cas cleavage and probe classification

CRISPR-Cas系统源于古菌的适应性免疫机制，其通过CRISPR RNA（crRNA）引导的Cas蛋白识别并切割外源遗传物质。不同Cas效应蛋白在分子诊断中展现出独特特性：Cas9通过sgRNA识别双链DNA（dsDNA）并执行顺式切割，但其应用受限于PAM序列依赖性和双RNA系统的复杂性。相比之下，Cas12和Cas13在crRNA引导下不仅能特异性识别DNA或RNA靶标，还能激活反式切割活性，非特异性降解单链DNA（ssDNA）或单链RNA（ssRNA）报告分子，从而实现高灵敏度核酸检测。

传统CRISPR诊断中，线性ssDNA和ssRNA探针被广泛用作报告分子，但其信号稳定性和灵敏度仍面临挑战。近年来，肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）等化学修饰探针通过增强杂交稳定性和核酸酶抗性，进一步提升了检测性能。然而，真正突破性的进展来自于高阶核酸结构的引入——这些具有精确三维构型的探针通过独特的信号机制显著增强了CRISPR系统的输出性能。

Elevating Sensitivity

提高检测灵敏度是CRISPR诊断走向临床应用的核心挑战。高阶核酸探针通过其特殊的空间结构和功能特性，为灵敏度提升提供了创新解决方案。例如，G-三链体（G3）探针在G-CRISPR平台中实现了20倍的灵敏度提升，能够检测到0.1 aM的扩增后质粒和50 pM的非扩增靶标。G-四链体（G4）结构则通过与血红素结合形成DNAzyme，催化显色反应产生强信号放大，在集成环介导等温扩增（LAMP）的检测系统中实现了低至20 CFU的沙门氏菌检测。

发光机制创新同样带来灵敏度突破。基于聚集诱导发光发光团（AIEgens）的探针通过限制分子内旋转产生强烈荧光信号，而FRET探针则通过能量转移效率变化实现信号放大。电化学发光（ECL）探针与ssDNA结合，使CRISPR平台达到aM级检测极限。特别值得一提的是MOECS平台，该平台将CRISPR系统与电化学传感器集成，通过在金电极上修饰亚甲基蓝-ssDNA-金纳米颗粒，在一小时内达到50 fM的检测限。

Enhancing Specificity

高阶核酸探针在提升检测特异性方面同样表现出色。其独特的空间构象允许更精确的分子识别，有效区分单碱基错配。Qu团队开发的双重调控策略，通过G4结合蛋白与小分子配体的协同作用，显著增强了CRISPR系统的特异性。发夹结构探针通过构象变化实现信号激活，只有在完全匹配的靶标存在时才会打开发夹结构，从而大幅降低非特异性信号。

G4探针的特殊性在于其形成需要特定的碱基序列和离子条件，这一特性被巧妙用于构建条件依赖性信号系统。只有在正确靶标存在时，G4结构才能稳定形成并与报告分子结合产生信号，这种双重验证机制极大提高了检测准确性。此外，一些探针设计还整合了内参控制，通过实时监控背景信号进一步确保结果可靠性。

Shortening Detection Time and Enabling Label-Free Detection

检测时间的缩短和无标记检测的实现是CRISPR诊断走向现场应用的关键。高阶核酸探针在这两方面展现出显著优势。G4-DNAzyme系统通过催化显色反应，无需荧光标记即可直接读取结果，大大简化了检测流程。电化学探针同样免除了标记步骤，通过电流变化直接输出信号。

在加速检测方面，这些探针通过增强信号强度和稳定性，显著缩短了信号积累所需时间。一些系统甚至实现了“混合读取”功能，只需简单混合反应组分即可观察结果，完全省去了复杂操作步骤。特别值得关注的是，这些探针与等温扩增技术（如LAMP、RPA）的整合，在保持高灵敏度的同时将总检测时间压缩至1小时以内，为现场即时检测提供了实用解决方案。

Conclusion and Prospective

高阶核酸探针的创新设计为CRISPR诊断技术的发展开辟了新途径。通过精确的分子工程，这些探针有效解决了CRISPR系统在灵敏度、特异性、信号稳定性和操作简便性方面的核心挑战。特别是G3、G4和发夹结构探针，它们不仅增强了检测性能，还推动了无标记、快速检测平台的发展。

未来研究应进一步探索探针结构与功能之间的关系，优化设计原则以实现更高效的信号转换。多模态探针的开发将允许同一平台进行多重检测，满足复杂诊断需求。与微流控技术和便携式读出设备的整合将是实现真正现场应用的关键步骤。此外，这些先进探针在临床样本中的验证工作仍需加强，以评估其在真实诊断环境中的性能。

最终，通过分子设计、功能优化与技术整合的协同创新，高阶核酸探针有望推动CRISPR诊断技术迈向新一代即时检测应用，在病原体检测、疾病筛查和精准医疗等领域发挥重要作用。