ALKBH8通过密码子特异性翻译调控KRAS表达驱动结直肠癌发生的新机制

本研究针对结直肠癌中Wnt/β-catenin信号通路异常激活但翻译水平调控机制不清的问题，发现ALKBH8作为β-catenin直接靶基因，通过催化tRNA wobble尿苷第34位mcm5U修饰，促进富含A-结尾密码子（AAA/CAA/GAA/AGA/GGA）的mRNA翻译延伸。特别证实了ALKBH8通过密码子依赖性方式调控KRAS翻译，其甲基转移酶活性是维持肠道肿瘤发生的关键。这项发表于《Nature Communications》的研究揭示了tRNA修饰介导的翻译调控新机制，为结直肠癌治疗提供了潜在靶点。

　　

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展涉及多步骤的遗传学和表观遗传学改变。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活被公认为结直肠癌发生的关键驱动事件，约90%的结直肠癌病例存在该通路的突变。然而，除了转录水平的调控外，基因表达在翻译水平的重编程如何参与肠道肿瘤发生的过程仍知之甚少。

在RNA修饰介导的基因表达调控中，转运RNA（tRNA）作为最富含修饰的RNA种类，其反密码环区尿苷第34位（U34）的化学修饰对mRNA翻译过程具有重要功能。ALKBH8作为一种尿苷甲基转移酶，负责催化形成5-甲氧基羰基甲基尿苷（mcm⁵U）修饰，但该酶在哺乳动物细胞翻译延伸中的作用尚未明确。同时，尽管研究表明U34 tRNA修饰级联反应在癌症发展中发挥重要作用，但ALKBH8在结直肠癌中的具体功能和机制仍有待阐明。

为解决这些问题，研究人员开展了系统性研究。关键技术方法包括：临床样本分析（TCGA数据库和80例结直肠癌患者组织芯片）、基因工程小鼠模型（Apc^min/+自发肿瘤模型和AOM/DSS诱导肿瘤模型）、细胞模型（HCT116和RKO细胞系）、质谱分析（tRNA修饰定量）、核糖体图谱分析（Ribo-seq）和单细胞RNA测序。

ALKBH8的表达受β-catenin调控并在结直肠癌中上调

通过β-catenin knockdownRNA测序结合染色质免疫共沉淀数据，研究人员鉴定出168个β-catenin直接靶基因，其中ALKBH8作为RNA修饰酶表现出显著变化。实验证实β-catenin直接结合ALKBH8启动子区TCF4 motif，调控其转录表达。临床样本分析显示，ALKBH8在Apc^min/+小鼠肠道肿瘤、AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌以及人类结直肠癌组织中均显著上调，且与CTNNB1 mRNA水平呈正相关。

ALKBH8缺失抑制肠道肿瘤发生

构建肠道上皮细胞特异性Alkbh8条件性敲除小鼠（Alkbh8^cKO）发现，虽然Alkbh8缺失对正常肠道稳态影响较小，但能显著抑制Apc^min/+小鼠肠道肿瘤形成，减少肿瘤数量和大小，并延长小鼠生存期。在AOM/DSS诱导的结直肠癌模型中，Alkbh8^cKO小鼠同样表现出肿瘤数量和尺寸的减少，单细胞RNA测序显示肿瘤中恶性上皮细胞减少，免疫细胞组成发生改变。

ALKBH8缺陷诱导密码子依赖性翻译重编程

质谱分析证实ALKBH8负责催化cm⁵U向mcm⁵U的转化，该修饰存在于tRNA^Lys(UUU)、tRNA^Gln(UUG)、tRNA^Glu(UUC)、tRNA^Arg(UCU)和tRNA^Gly(UCC)的反密码子区。核糖体图谱分析显示，ALKBH8敲除细胞在核糖体A位点针对AAA、CAA、GAA、AGA和GGA五个A-结尾密码子出现核糖体滞留现象，导致富含这些密码子的mRNA翻译延伸受损。

ALKBH8调控KRAS的翻译延伸

通过富集分析发现，细胞周期通路中的关键基因如KRAS和CDK1受到ALKBH8特异性调控。实验证实ALKBH8通过密码子依赖性方式调控KRAS翻译，而不影响其mRNA水平。将KRAS基因中的A-结尾密码子替换为同义G-结尾密码子后，ALKBH8对KRAS表达的调控作用消失，证明该调控具有密码子特异性。

甲基转移酶结构域是ALKBH8调控翻译所必需的

通过点突变实验发现，ALKBH8的甲基转移酶结构域关键氨基酸突变体无法恢复ALKBH8敲除细胞中mcm⁵U修饰水平、全局翻译、KRAS表达以及细胞增殖能力，表明ALKBH8通过其甲基转移酶活性发挥功能。

KRAS参与ALKBH8介导的细胞周期进程

功能实验表明，KRAS敲除导致G1期阻滞，而ALKBH8敲除细胞表现出类似的细胞周期表型。在ALKBH8敲除细胞中重新表达KRAS能够恢复细胞周期进程和体内肿瘤生长，临床样本分析显示ALKBH8与KRAS表达呈正相关。

本研究首次揭示了ALKBH8作为Wnt/β-catenin信号通路直接靶点，通过调控tRNA mcm⁵U修饰影响密码子特异性翻译，进而促进结直肠癌发生发展的新机制。特别重要的是，研究发现ALKBH8通过调节富含A-结尾密码子的mRNA（如KRAS）的翻译延伸效率，在肠道肿瘤发生中发挥关键作用。该研究不仅深化了对翻译水平基因表达调控在肿瘤中作用的理解，而且为结直肠癌治疗提供了新的潜在靶点。由于ALKBH8在正常肠道组织中表达较低而在肿瘤中特异性上调，针对ALKBH8的治疗策略可能具有较好的肿瘤特异性，为开发新型结直肠癌治疗方法提供了理论依据。