供体链互补与钙离子协同驱动古菌cannulae的无伴侣蛋白聚合机制

本研究针对超嗜热古菌Pyrodictium abyssi胞外cannulae蛋白丝的高稳定性机制，通过冷冻电镜解析了天然和重组cannulae的原子结构，发现其聚合依赖供体链互补(DSC)这一细菌菌毛常见机制，但首次揭示钙离子在亚基界面形成I/II/III型配位中心强化相互作用。该研究阐明了钙离子触发构象变化促使DSC的分子开关机制，为开发耐高温蛋白质纳米材料提供了新范式。

　　

在深海热液喷口等极端环境中生存的超嗜热古菌Pyrodictium abyssi，其细胞表面会形成一种名为cannulae的管状蛋白质丝状结构。这些蛋白丝在高达110°C的温度下仍能保持稳定，相互连接细胞形成生物基质，但它们的分子组装机制和稳定性来源一直是个谜。由于Pyrodictium abyssi培养条件苛刻且难以进行遗传操作，严重限制了对其cannulae结构的深入研究。解决这一问题不仅有助于理解古菌生物膜的形成机制，也为开发新型耐高温蛋白质纳米材料提供了可能。

研究人员通过冷冻电镜(cryoEM)技术，分别解析了从Pyrodictium abyssi AV2菌株中直接分离的天然cannulae以及在大肠杆菌中表达的重组CanA蛋白在体外自组装形成的cannulae样管状结构的高分辨率结构。令人惊讶的是，还发现了一种来自未培养 Thermoproteota 门古菌的重组cannulae样蛋白Hyper2也能形成类似结构。研究揭示这些丝状结构的组装均通过供体链互补(DSC)机制实现，这是首次在古菌中发现此类聚合方式。

关键技术方法包括：通过冷冻电镜解析天然cannulae(2.3?)和重组CanA(2.6?)、Hyper2(3.5?)丝状结构；利用X射线晶体学获得CanA单体结构；采用沉降速度分析性超速离心(SV-AUC)表征蛋白组装状态；结合生物信息学工具(HMMER、Foldseek、AlphaFold)进行同源蛋白鉴定和结构预测。

CryoEM分析天然P. abyssi胞外丝状结构

研究发现Pyrodictium abyssi AV2的胞外环境中存在两种主要丝状结构：直径约26nm的cannulae和直径约2nm的纤细纤维。冷冻电镜结构解析显示cannulae由C2对称的双原丝构成，螺距94.6?，每个原丝内亚基轴向上升3.18?，旋转12.1°。结构模型揭示亚基通过N端供体链插入相邻亚基的受体沟槽实现轴向连接(i→j→k)，同时通过I/II型钙离子配位中心强化轴向相互作用，III型钙离子中心介导径向相互作用(j-1→j→j+1)。研究将主要亚基鉴定为CanX，并发现其Asn51位点存在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖基化修饰。

重组P. abyssi cannulae的结构分析

重组CanA蛋白在钙离子存在下通过热处理可自组装成直径约27nm的管状结构，其冷冻电镜结构显示为C1对称的单原丝螺旋组装，亚基轴向上升46?，旋转1.25°。尽管螺旋对称性与天然cannulae不同，但DSC相互作用和钙离子配位模式高度保守。与CanX相比，CanA蛋白含有两个较大的表面环区插入，形成明显的螺旋脊线。晶体结构显示CanA单体中N端供体链呈无序状态，而钙离子结合可诱导环区构象变化，暴露出受体沟槽，为DSC创造条件。

钙离子结合在cannulae组装中的潜在作用

研究表明钙离子结合是CanA聚合的必要但非充分条件，需要热处理促进快速组装。晶体结构与冷冻电镜结构对比发现，钙离子结合稳定了34-40和161-173环区构象，使受体沟槽处于开放状态，允许供体链插入。在天然海水环境中，高钙离子浓度(约10mM)和高温(约100°C)可能共同触发cannulae蛋白在细胞表面的聚合。镁离子在相同条件下不能诱导聚合，而铽离子(Tb³⁺)可作为钙离子替代物有效诱导组装。

重组cannulae样蛋白同源物的冷冻电镜分析

从宏基因组数据中鉴定的Hyperthermus物种cannulae样蛋白Hyper2可在常温下通过钙离子诱导自组装，形成直径240?和270?两种单壁管状结构。冷冻电镜结构显示它们分别采用C8和C1对称性，但都保留了保守的DSC机制和钙离子配位中心。与Pyrodictium cannulae的双原丝结构不同，Hyper2组装体包含八个原丝，沿8-start螺旋排列，但原丝间距(约4.6-4.7nm)与Pyrodictium cannulae相似，表明DSC相互作用的几何约束在进化中高度保守。

cannulae样蛋白在古菌中的分布

系统发育分析表明CanX同源物仅分布于Pyrodictiaceae科古菌中，而AbpX同源物在古菌中分布更广，且与细菌TasA超家族蛋白具有同源性。研究发现Saccharolobus solfataricus等古菌中也存在结构相似的cannulae样蛋白，尽管序列同一性低至18%，但AlphaFold预测的jelly-roll折叠结构高度保守。这些蛋白可能代表了一个在古菌中广泛存在但尚未被充分认识的蛋白质超家族。

研究结论表明，古菌cannulae的组装机制独特性在于：一方面采用细菌CU菌毛常见的DSC聚合方式，但不需要伴侣蛋白-转位酶系统参与；另一方面通过钙离子配位网络强化亚基界面相互作用，这一特征与RTX粘附素和S层蛋白的钙离子依赖性折叠有相似之处。这种钙离子触发的自组装机制为开发新型蛋白质纳米材料提供了新思路，其大尺寸内腔(约18nm)也为设计药物输送载体等生物技术应用提供了可能。同时，cannulae与DNA样纤维的腔内相互作用暗示其在古菌细胞间通讯或遗传物质交换中可能发挥功能，为理解古菌生物膜的组织原理提供了新视角。