Munc13-4通过调控外泌体PD-L1分选分泌介导肿瘤免疫逃逸的新机制

本刊推荐：为解决肿瘤免疫检查点抑制剂耐药性难题，研究人员聚焦于外泌体PD-L1的分泌机制。研究发现Munc13-4通过形成HRS-Munc13-4-PD-L1三元复合物调控PD-L1分选，并与Rab27a-SNARE复合物协作介导多泡体与质膜融合。该研究揭示了干扰素γ通过调控Munc13-4乙酰化和HRS去泛素化动态调节PD-L1分选的分子机制，为增强免疫治疗效果提供了新靶点。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂虽然给部分患者带来了希望，但仍有相当比例的患者面临治疗耐药性的挑战。近年来研究发现，肿瘤细胞分泌的外泌体携带PD-L1分子，这些循环中的PD-L1能够远程抑制T细胞功能，导致局部和全身性的免疫抑制状态。然而，调控外泌体PD-L1分选和分泌的具体分子机制尚不明确，这成为制约免疫治疗效果提升的关键科学问题。

针对这一空白，华中科技大学刘楚奇、刘德祥等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，系统揭示了Munc13-4在调控外泌体PD-L1分选分泌中的核心作用。研究发现，在乳腺癌细胞中敲除Munc13-4能够显著增强T细胞介导的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，并提高免疫检查点抑制剂的疗效。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Munc13-4敲除的细胞系；利用蛋白质组学分析筛选差异表达蛋白；采用低温电子显微镜解析Munc13-4-Rab27a复合物三维结构；通过体外膜融合实验验证SNARE复合物组装机制；使用人源组织芯片进行免疫组化分析；建立小鼠原位乳腺肿瘤模型评估体内治疗效果。

Munc13-4缺陷抑制肿瘤免疫依赖性生长

研究发现Munc13-4在多种肿瘤组织中显著上调，在免疫健全的小鼠模型中，Munc13-4敲除使肿瘤体积减少至野生型的17.17%，而在免疫缺陷小鼠中这种抑瘤效应明显减弱，表明Munc13-4的作用依赖于免疫系统。

Munc13-4缺陷增强T细胞浸润与活化

流式细胞术分析显示，Munc13-4敲除肿瘤中CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润显著增加，颗粒酶B、Ki67和IFNγ等活化标志物表达上调，证实Munc13-4缺陷增强了系统性T细胞免疫应答。

Munc13-4促进PD-L1分泌抑制T细胞抗肿瘤效能

Western blot显示Munc13-4敲除不影响PD-L1总蛋白水平，但显著降低外泌体PD-L1含量。体外杀伤实验证实Munc13-4缺陷细胞更易被T细胞清除，而回输对照外泌体可恢复肿瘤生长，该效应依赖于外泌体PD-L1。

Munc13-4不影响多泡体生物合成

电镜观察发现Munc13-4敲除细胞中多泡体数量增加、直径增大，且与溶酶体融合增多，表明Munc13-4缺失导致多泡体降解增强，而非影响其形成。

Munc13-4促进多泡体锚定与质膜融合

低温电镜结构解析显示Munc13-4与Rab27a通过F46/W73/F88-N739/T740/V660/K661界面相互作用，突变这些位点增加多泡体运动性。FRET实验证实Munc13-4促进Syntaxin-4/SNAP-23/VAMP-7 SNARE复合物组装和膜融合。

Munc13-4与HRS协同介导PD-L1外泌体分选

免疫共沉淀和邻近连接实验发现Munc13-4分别与PD-L1和HRS直接结合，形成三元复合物。Munc13-4缺失破坏HRS-PD-L1相互作用，导致PD-L1错误定位至溶酶体。

IFNγ通过修饰Munc13-4和HRS调控PD-L1分选

IFNγ刺激诱导Munc13-4 K1062/K1079位点乙酰化（由CBP催化，HDAC3去乙酰化），抑制其与PD-L1结合；同时促进HRS去泛素化（NEDD4L介导泛素化），增强HRS-PD-L1相互作用。这两种相反效应形成PD-L1分选的精细调控。

靶向PD-L1-Munc13-4相互作用的肽段抑制肿瘤生长

基于PD-L1跨膜-胞质连接区设计的干扰肽（P-pep）能特异性破坏Munc13-4-PD-L1相互作用，降低外泌体PD-L1水平，增强肿瘤内T细胞浸润和杀伤功能，抑制肿瘤生长且无系统毒性。

该研究首次系统阐明了Munc13-4在外泌体PD-L1分选分泌中的核心调控作用，揭示了肿瘤细胞通过Munc13-4乙酰化和HRS泛素化动态调节免疫检查点分子分泌的适应性机制。研究不仅深化了对肿瘤免疫逃逸机制的理解，更为克服免疫治疗耐药性提供了新策略——靶向Munc13-4-PD-L1相互作用可特异性阻断免疫抑制性外泌体的产生，同时保留外泌体的免疫刺激功能，具有重要的转化医学价值。