仿生铁蛋白纳米笼协同递送二甲双胍和雷帕霉素恢复自闭症谱系障碍神经发育稳态的研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Biomimetic ferritin nanocages for synergistic co-delivery of metformin and rapamycin restore neurodevelopmental homeostasis in autism spectrum disorders

本研究针对自闭症谱系障碍(ASD)复杂病因和治疗困境，开发了基于重链铁蛋白(HFn)的仿生纳米复合物HFn@M/R，实现了二甲双胍(Met)和雷帕霉素(Rapa)的协同递送。该纳米载体通过转铁蛋白受体1(TfR1)介导的血脑屏障穿透，在VPA诱导的ASD大鼠模型中显著改善行为缺陷，恢复海马电生理模式，并通过调控AMPK/mTOR信号通路逆转线粒体功能障碍和神经炎症。该研究为ASD的精准治疗提供了创新性纳米医学策略。

　　

在神经科学领域，自闭症谱系障碍(ASD)始终是困扰研究人员的一大难题。这种复杂的神经发育障碍表现为社交沟通缺陷、重复刻板行为等症状，其患病率呈逐年上升趋势。尽管遗传突变和环境因素共同参与发病过程，但线粒体功能障碍、氧化应激和神经炎症的相互作用进一步加剧神经元损伤。当前临床主要采用行为干预和利培酮、阿立哌唑等对症药物治疗，但这些手段对核心症状改善有限且常伴随不良反应。面对ASD的多因素病因特征，开发能够同时靶向多重病理环节的治疗策略迫在眉睫。

雷帕霉素(Rapa)作为mTOR信号通路抑制剂，能恢复自噬清除功能并减轻神经炎症，但其水溶性差、系统免疫抑制和血脑屏障(BBB)穿透能力有限限制了临床应用。与之互补的二甲双胍(Met)是AMP激活蛋白激酶(AMPK)激活剂，可改善线粒体功能失调并通过调控cAMP反应元件结合蛋白(CREB)促进脑源性神经营养因子(BDNF)表达。研究表明Met-Rapa联合治疗在缺血再灌注损伤模型中通过缓解氧化应激和抑制凋亡发挥协同保护作用，这为ASD的联合治疗提供了理论依据。

发表于《Journal of Nanobiotechnology》的这项研究创新性地利用重链铁蛋白(HFn)纳米笼构建了双药递送系统HFn@M/R。研究人员通过大肠杆菌表达系统合成HFn载体，采用pH诱导解组装方法实现高效载药（每个HFn装载123个Met分子和19个Rapa分子）。该纳米系统凭借其H亚基与脑内皮细胞高表达的TfR1特异性结合，实现受体介导的跨血脑屏障转运。

关键技术方法包括：1）采用大肠杆菌表达系统和色谱纯化技术制备HFn纳米笼；2）通过pH驱动组装法实现双药物装载；3）建立VPA诱导的SD大鼠ASD模型进行行为学评价（三室社交实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫等）；4）运用多通道脑电图记录海马CA3区神经电活动；5）通过转录组测序分析差异表达基因及其富集通路。

结果与讨论

HFn@M/R的合成表征及刺激响应性释放

研究人员通过比较被动扩散和pH诱导解组装两种载药方法，发现pH驱动法具有更优的载药效率（每个HFn装载61个Met和12个Rapa）。透射电镜显示HFn@M/R保持均匀球形结构，动态光散射测定其流体动力学直径为26nm，zeta电位为-31.10±6.62mV，确保护胶体稳定性。圆二色谱验证了纳米颗粒二级结构的完整性。药物释放实验表明，在模拟ASD病理环境（pH5.0、氧化应激）下，Met和Rapa均呈现加速释放特性，其中在氧化应激条件下Met累积释放率达86%。

生物相容性及靶向机制验证

细胞毒性实验表明在SH-SY5Y、bEnd.3和GMI-R1细胞中，HFn@M/R在0.1-10μM浓度范围内细胞存活率均高于85%。溶血分析显示HFn蛋白壳能完全预防游离药物引起的溶血反应。AlphaFold3结构预测揭示了HFn通过四个关键接触区域与TfR1结合，流式细胞术证实HFn-Cy5.5在SH-SY5Y细胞中的摄取量显著高于游离Cy5.5，且该过程可被TfR1抗体竞争性抑制。在建立的血脑屏障Transwell共培养模型中，HFn-Cy5.5在24小时时在SH-SY5Y细胞中的荧光强度达到游离Cy5.5的3.3倍。活体荧光成像显示HFn@ICG在注射后1小时即实现脑内富集，8-12小时达到峰值并持续24小时。

体外治疗效果评估

在VPA诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中，HFn@M/R呈剂量依赖性恢复细胞活力。JC-1检测显示VPA引起线粒体膜电位去极化（绿色荧光强度增加26.3%），而HFn@M/R处理使荧光信号恢复至对照组水平。mt-ND1基因拷贝数分析进一步证实HFn@M/R能逆转VPA引起的线粒体DNA损伤。Western blot结果表明VPA抑制AMPK磷酸化（p-AMPK/AMPK）、CREB激活（p-CREB/CREB）和BDNF表达，同时激活mTOR（p-mTOR/mTOR）并导致自噬标志物p62积聚。HFn@M/R处理使这些指标均恢复正常水平，表明其通过协同调控AMPK-mTOR通路发挥神经保护作用。

氧化应激、凋亡和神经炎症的调控

共聚焦显微镜显示VPA处理的SH-SY5Y细胞中ROS绿色荧光强度显著增强，流式细胞术定量显示其较对照组升高1.8倍。HFn@M/R处理使ROS水平降低46.6%。凋亡检测表明Met主要通过维持线粒体完整性发挥抗凋亡作用，而Rapa选择性抑制mtDNA/NF-κB驱动的细胞因子产生。在GMI-R1细胞中，qPCR分析显示VPA诱导IL-6、TNF-α和NF-κB mRNA上调，HFn@M/R处理能最大程度降低这些炎症因子表达。

ASD大鼠模型中的治疗效应

在VPA诱导的ASD大鼠模型中，HFn@M/R治疗显著改善行为学缺陷。三室社交实验显示其逆转社交回避行为，高架十字迷宫和旷场实验表明焦虑样行为减少，Y迷宫自发交替率恢复至65.1%，Morris水迷宫空间记忆测试显示目标象限停留时间显著延长。海马CA3区脑电图记录发现VPA暴露大鼠出现局部场电位振幅升高和信号波动增强，HFn@M/R处理使这些异常电活动恢复正常。组织学分析显示HFn@M/R减少海马神经元凋亡，恢复神经元密度和形态，并显著降低小胶质细胞标志物Iba1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达，表明神经炎症得到有效控制。

分子机制深度解析

转录组分析揭示VPA处理组相比WT组有98个基因上调和214个基因下调，GO富集显示抗原加工呈递等免疫相关过程，KEGG分析识别出RIG-I样受体和NOD样受体信号通路。HFn@M/R特异性调控36个上调和23个下调差异表达基因，涉及神经递质调节因子（Tph1、Oxt）、代谢/氧化应激调节因子（Alas2、Acsm5）和神经发育元件（Foxp2）。GO分析显示钙介导信号传导和淀粉样β形成负调控等关键生物过程富集，KEGG通路分析表明神经活性配体-受体相互作用、色氨酸代谢、cAMP信号通路等显著富集。这些发现证实HFn@M/R通过多靶点网络协同增强突触功能、代谢重编程和免疫-神经交互作用。

研究结论与意义

本研究成功构建了HFn@M/R这一多功能纳米医学平台，通过HFn纳米笼的双药协同递送系统，实现了对ASD多因素病理的精准干预。该平台不仅证实了优异的血脑屏障穿透能力和生物安全性，更在分子层面通过协调调控AMPK和mTOR依赖的信号通路，逆转线粒体功能障碍、恢复自噬流、减轻神经炎症。在动物模型中展现出显著的行为改善和电生理恢复正常的效果。转录组学分析进一步揭示了其通过重塑神经发育、代谢和免疫网络发挥治疗作用的分子基础。该研究为ASD的精准治疗提供了新范式，也为其他神经发育障碍和神经炎症性疾病的治疗策略开发奠定了理论基础。未来研究将聚焦于遗传ASD模型验证、长期毒性评估以及纳米-生物相互作用机制的深入解析，推动该平台向临床转化迈进。