解耦酵母蛋白生产与生长的策略：胞内积累与分泌蛋白的差异化优化路径

本研究针对精准发酵中重组蛋白产量低的问题，探索了在酿酒酵母中通过控制低比生长速率(μ)解耦蛋白生产与生长的策略。比较组成型启动子PTEF1和应激诱导型启动子PHSP12发现，PHSP12在极低生长速率下使胞内蛋白产量提高10倍，而PTEF1则显著提升分泌效率。研究表明胞内与分泌蛋白生产需要不同的优化策略，为高效微生物蛋白生产提供了新思路。

　　

随着气候变化和粮食安全问题的日益突出，精准发酵(precision fermentation)作为一种可持续的蛋白质生产途径备受关注。然而，与传统生物质产量相比，重组蛋白的底物转化率仍然较低。这主要是因为微生物在发酵过程中会将大量底物用于生长而非目标产物合成。如何在保证生产效率的前提下，实现重组蛋白生产与细胞生长的解耦(uncoupling)，成为提高蛋白产量的关键科学问题。

以往的两阶段生产工艺主要依靠诱导剂(如碳源转换)在生长阶段后激活重组蛋白生产。但在大规模生产中，通过控制营养可用性来调节比生长速率(specific growth rate, μ)可能是一种更实用的策略。来自荷兰瓦赫宁根大学的研究团队在《Microbial Cell Factories》上发表的研究，系统探讨了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，利用低比生长速率(0.02 h^-1 < μ < 0.1 h^-1)解耦重组蛋白生产的可行性，并比较了胞内积累与分泌蛋白的不同优化策略。

研究人员选择了两种不同调控机制的启动子：强组成型启动子P_TEF1(Translation Elongation Factor 1-alpha promoter)和应激诱导型启动子P_HSP12(Heat Shock Protein 12 promoter)。通过恒流补料分批培养(fed-batch cultivation)技术，他们创建了从初始0.081 h^-1逐渐降至0.015 h^-1的低比生长速率环境，系统监测了蛋白表达动力学。

为开展此项研究，团队运用了几项关键技术：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了整合表达荧光蛋白的酵母工程菌株；采用流式细胞术(flow cytometry)定量分析胞内蛋白表达水平；建立基于荧光强度的蛋白分泌检测方法；应用Pirt模型分析底物分配与代谢动力学。所有实验均使用标准酿酒酵母CEN.PK系列菌株。

Effect of intracellular protein expression on physiology

补料分批培养过程中，细胞活性保持在98%以上，但平均细胞尺寸显著增加至1.5倍。通过Pirt模型估算，非生长相关的葡萄糖消耗占总消耗的37.0±0.0%，这一数值包含了细胞维持需求(maintenance energy requirement)和部分非生长条件下的产物形成。

Expression driven by TEF1 promoter shows a positive correlation with the specific growth rate

P_TEF1驱动的ymNeongreen蛋白表达显示出与比生长率的正相关线性关系(p<0.0001，Pearson r=0.9998)。尽管单个细胞的荧光强度随生长速率降低而下降，但由于生物量浓度的增加，总蛋白滴度保持相对稳定。线性回归分析揭示了一个显著的非生长依赖性特异生产率(m_P)，表明P_TEF1在非生长条件下仍保持一定活性。

Expression driven by P_HSP12 enables strong increase in intracellular protein titers

P_HSP12驱动的mRuby2表达呈现出与P_TEF1相反的趋势。在补料开始时，仅12.6±3.6%的细胞显示高荧光强度，而培养4小时后(μ=0.058 h^-1)，高荧光细胞比例急剧上升至81.7±2.3%。培养结束时，这一比例进一步增加至96.6±1.0%。结合生物量浓度的增加，mRuby2滴度提高了10倍。虽然比生产率(q_P)仍与生长率呈正相关，但回归参数的不同导致了在低生长速率下产物得率的增加。

Impact of promoter on correlation between protein secretion and specific growth rate

对于分泌型蛋白，P_HSP12在最初25小时内使细胞外蛋白滴度增加2.6倍，但此后趋于稳定。相反，P_TEF1驱动的分泌虽然初始滴度较低，但在整个培养期间持续增加，最终滴度比P_HSP12高1.5倍。比分泌速率(q_P^ex)与生长率的相关性也呈现明显差异：P_HSP12呈正相关，而P_TEF1呈负相关。

Effect of protein expression and secretion on physiology

P_HSP12驱动的表达导致更高的非生长相关葡萄糖消耗(0.018±0.007 g/g/h)，而P_TEF1菌株的消耗率(0.008±0.003 g/g/h)与亲本菌株相近。P_HSP12还导致细胞活性下降至89.0±3.1%，表明其引起了较大的代谢负担(metabolic burden)。分泌效率分析显示，P_TEF1的分泌效率(q_P^ex/q_P)增加了3倍以上，而P_HSP12则下降了40%。

研究结论表明，启动子选择在缓慢生长条件下的生产性能中起着关键作用。P_HSP12在极低生长速率下实现了胞内蛋白产量的显著提升，而P_TEF1则通过提高分泌效率在细胞外蛋白生产中表现更优。这种差异主要源于P_HSP12高强度表达可能触发了未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，导致分泌途径瓶颈。该研究强调了胞内与胞外重组蛋白生产需要不同的优化策略，为精准发酵工艺的改进提供了重要理论依据和实践指导。通过合理选择启动子和优化培养策略，有望在非生长或缓慢生长条件下实现重组蛋白的高效生产，从而大幅提高底物转化率和经济可行性。