地衣芽孢杆菌胞外聚合物生物合成的应激响应调控：从全局转录调控到代谢工程新策略

《Microbial Cell Factories》：Stress response regulation to extracellular polymeric substances biosynthesis in Bacillus licheniformis

本研究针对地衣芽孢杆菌胞外聚合物（EPS和γ-PGA）合成竞争的调控机制难题，通过多重应激诱导结合全局转录调控工程策略，揭示了应激响应通过重组代谢和细胞过程调控聚合物合成的分子机制，发现关键调控因子nrgB和cggR可显著提高γ-PGA产量（分别增加33.64%和44.14%），为芽孢杆菌胞外聚合物的高效定向合成提供了重要理论依据和技术支撑。

　　

在微生物合成领域，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）因其能同时合成两种具有重要应用价值的胞外聚合物——外多糖（EPS）和γ-聚谷氨酸（γ-PGA）而备受关注。这两种聚合物在食品、医药、环保等领域展现出广阔的应用前景。然而，它们的合成途径存在竞争关系：EPS合成主要以碳水化合物为碳源，而γ-PGA合成则偏好甘油和α-酮戊二酸。这种代谢竞争使得在单一菌株中实现多种聚合物的协同高效合成面临巨大挑战。更棘手的是，人们对这两种聚合物合成的全局调控机制了解有限，这严重阻碍了通过代谢工程手段精确调控聚合物合成比例的努力。

发表在《Microbial Cell Factories》的这项研究开创性地将应激诱导策略与全局转录机制工程相结合，首次系统揭示了环境应激如何通过调控全局转录因子来协调地衣芽孢杆菌中EPS和γ-PGA的合成竞争关系。

研究人员采用了多组学联用分析技术策略，包括：通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行非靶向代谢组学分析应激条件下的代谢物变化；利用转录组测序（RNA-seq）鉴定差异表达基因；采用定量实时PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达；结合蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络预测（STRING数据库）和基因功能富集分析（GO和KEGG分析）；并在1.5升发酵罐中进行规模放大验证。

多重应激对胞外聚合物生产的影响

研究发现不同环境应激对EPS和γ-PGA生产产生差异化影响。在高渗应激（16 g/L NaCl）条件下，γ-PGA产量达到5.22 g/L，较对照提高54.33%，但分子量有所降低。碱性应激（pH=9）使γ-PGA产量增加20.88%，而酸性应激（pH=5）则使EPS产量增加89.98%。高温应激（55°C）使EPS产量增加49.26%，但超过55°C会显著抑制γ-PGA合成。在联合应激（pH9+16g/L NaCl+55°C）条件下，生物量从0.36 g/L增加到1.46 g/L，γ-PGA产量提高18.96%至3.79 g/L，而EPS产量降低12.77%。

多重应激下的代谢物谱分析

代谢组学分析显示，在应激条件下，脯氨酸（proline）、FAD、瓜氨酸（citrulline）、谷氨酰胺（glutamine）和甘油-3-磷酸（glycerol 3-phosphate）等代谢物上调，而N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine）、N-乙酰甘露糖胺（N-acetylmannosamine）和N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine）等EPS合成单元下调。谷氨酸和谷氨酰胺分别上调2.35倍和3.28倍，为γ-PGA合成提供了前体物质。脯氨酸和瓜氨酸作为渗透调节剂，含量显著增加（分别14.27倍和4.55倍），可转化为谷氨酸，补充γ-PGA合成前体。

群体感应相关全局调控因子的过表达促进胞外聚合物合成

研究发现群体感应（QS）相关全局调控因子rsbRA和rapA能促进EPS和γ-PGA合成。rsbRA突变株使EPS产量达到8.76 g/L（提高5.12%），EPS比例升至8.34%。rapA突变株使EPS和γ-PGA产量分别增加43.89%（518 mg/L）和31.47%（2.77 g/L）。相反，codY和nadR作为EPS和γ-PGA合成的负调控因子。

蛋白互作和qRT-PCR分析显示，rsbRA通过上调sigB（增加3.45倍）调控应激响应，并激活EPS合成途径中的糖基转移酶基因epsG（增加1.5倍）。rapA调控株中，核苷酸糖前体合成途径相关基因（glmU、tuaD、gtaB）和EPS转运聚合相关基因（epsH、epsO）均出现不同程度上调，共同促进EPS生物合成。

碳氮利用相关全局调控因子的过表达促进胞外聚合物合成

碳利用相关全局调控因子cggR使γ-PGA产量增加20.56%至3.87 g/L，而氮利用相关调控因子nrgB使γ-PGA产量显著增加33.64%至4.29 g/L，占胞外聚合物总量的53.17%。相反，EPS产量降至270.47 mg/L，比例降至3.35%。

蛋白互作和表达分析表明，cggR调控的糖酵解途径基因普遍上调，但EPS合成途径中的glmU基因下调。在γ-PGA合成途径中，丙酮酸激酶基因pyk和丙酮酸脱氢酶基因pdhD在OE-cggR菌株中上调，表明代谢流向γ-PGA合成转移。规模放大发酵显示，OE-cggR菌株在50小时时γ-PGA产量达到3.98 g/L，提高16.4%。

全局调控因子NrgB的转录组学分析

转录组分析发现nrgB过表达导致52个显著差异表达基因（29个上调，23个下调）。这些基因主要富集在细胞代谢过程、细胞生理过程和单生物过程等生物学过程类别中。KEGG通路分类显示，大多数代谢通路显著上调，特别是全局概览图（8个差异基因）和碳水化合物代谢（7个基因）。

在氨基和核苷酸糖代谢中，wbpA（包括编码UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰甘露糖胺脱氢酶的wbpA1和wbpA2）表达下调。这些酶产生多糖合成必需的酸类。同时，与淀粉和蔗糖代谢途径相关的5个基因（glgA、glgB、glgC、glgD、glgP）也显示表达降低。在糖途径中，lytD（肽聚糖水解酶组成部分）上调，有助于早期细菌生长和分裂，表明糖降解增强。

代谢途径映射显示，在糖酵解途径中，编码6-磷酸己酮糖异构酶的hxlB表达下调。在磷酸戊糖途径的脂代谢分支途径中，编码甘油脱氢酶的egsA转录上调最显著。在氨基酸代谢中，编码乙酰-CoA酰基转移酶家族蛋白的fadA显著下调。在氮代谢途径中，编码硝酸还原酶γ亚基的narI显著上调，催化亚硝酸盐转化为氨，进而促进谷氨酰胺合成，为γ-PGA合成提供前体。

研究表明，nrgB过表达通过抑制EPS合成基因同时增强糖降解基因，重新编程代谢网络，使碳氮代谢流向γ-PGA合成，并通过增强信号转导和膜转运活动，提高能量代谢效率。

本研究通过整合环境扰动与全局转录工程，系统解析了地衣芽孢杆菌中EPS和γ-PGA合成的竞争性相互作用机制。研究发现多种环境应激通过激活前体合成、碳源利用和氨基酸代谢途径，调控两种聚合物的合成平衡。关键全局调控因子如rsbRA、rapA、ccpA-2、cggR和nrgB被鉴定为调控这一过程的核心元件，其中nrgB和cggR能分别提高γ-PGA产量33.64%和44.14%。这些发现不仅深化了对细菌胞外聚合物合成调控网络的理解，而且为通过代谢工程手段优化地衣芽孢杆菌生产特定胞外聚合物提供了关键靶点和理论依据，对推动微生物合成生物学在工业生物技术中的应用具有重要意义。