冰草属叶绿体基因组比较分析揭示其高度保守性及物种鉴定挑战

《BMC Genomics》：Comparative analysis of Chloroplast genomes in 48 samples from 5 species and 2 varieties of Agropyron Gaertn. (Poaceae, Triticeae)

本研究针对冰草属(Agropyron)植物形态变异复杂、传统分类困难的问题，通过二代测序技术对5种2变种48份样本进行叶绿体基因组比较分析。研究发现冰草属叶绿体基因组具有高度保守的四分段结构(135,321-135,564 bp)，鉴定出6个高变区域(psbA、rpl32等)，但系统发育分析显示种间关系未解决，仅发现178个系统发育信息位点(0.13%)。该研究为禾本科植物进化提供了重要基因组学证据，发表于《BMC Genomics》。

　　

在广袤的北半球温带草原上，冰草属(Agropyron)植物作为重要的牧草资源，以其丰富的营养价值和优良的适口性成为畜牧业发展的基石。然而，这类具有重要生态和经济价值的植物却长期陷入分类学的泥潭——由于复杂的形态变异、自然杂交和人工育种活动，仅凭传统的形态特征难以实现准确鉴定。更令人困惑的是，不同分类学家对冰草属的物种划分存在巨大分歧：20世纪90年代，多数苏联学者只承认两个物种，而Tsvelev等人却描述了十个物种，这种分类学上的混乱严重制约了种质资源的有效利用。

面对这一挑战，郑丽娜研究团队将目光投向了植物细胞中的"分子化石"——叶绿体基因组。这种环状DNA分子因其结构保守、进化速率慢的特点，已成为植物系统发育研究的理想材料。特别是"超级条形码"(superbarcoding)概念的提出，使得利用多个基因组区域进行物种鉴定成为可能，为解决冰草属分类难题提供了新的技术路径。

研究团队采用二代高通量测序技术，对中国北方7个省区采集的48份冰草属样本(涵盖5个物种和2个变种)进行叶绿体基因组测序与组装。通过比较基因组学、重复序列分析、密码子使用偏好性评估以及系统发育重建等多维度分析方法，全面解析了冰草属叶绿体基因组的特征。

关键技术方法包括：基于CTAB法的DNA提取和DNBSEQ-T7平台测序；GetOrganelle软件进行叶绿体基因组组装；REPuter和MISA分析重复序列；MAFFT进行基因组比对；IQ-TREE构建最大似然系统发育树；DnaSP计算核苷酸多样性(Pi)；STRUCTURE分析群体遗传结构。

叶绿体基因组特征

研究显示冰草属叶绿体基因组具有典型的四分段结构，长度范围在135,321-135,564 bp之间，变异率仅0.18%。所有样本均编码132个基因(84个蛋白编码基因、40个tRNA基因和8个rRNA基因)，GC含量稳定在38%。特别值得注意的是，采自新疆的A. cristatum样本(AC1734)的小单拷贝区(SSC)显著缩短(12,634 bp)，可能是干旱环境下的适应性进化特征。

叶绿体基因组重复序列分析

简单重复序列(SSR)分析发现每个样本含有39-47个SSR，其中A/T型单核苷酸重复最为丰富(21-28个)，而C/G型仅0-1个。串联重复数量为29-34个，以A. mongolicum(0506)最多(34个)。长重复序列中以回文重复(13个)和正向重复(29-31个)为主，未发现反向或互补重复。

密码子使用偏好性分析

相对同义密码子使用度(RSCU)分析显示，冰草属叶绿体基因组明显偏好A/U结尾的密码子(48.4%的密码子RSCU>1)。使用频率最高的密码子是UUA(Leu)，而CUG(Leu)使用频率最低。GC3值在0.2661-0.2670之间，进一步证实了A/U结尾密码子的优势地位。

叶绿体基因组边界分析

IR区边界分析显示基因分布高度保守，rps19基因位于IRb/LSC边界附近，rps15基因靠近IRa/LSC边界，ndhH基因横跨SSC/IRa区域。所有样本在IRb/SSC边界均形成一个假基因ΨndhH，这种微小的边界基因位移可能是冰草属在复杂生境压力下微进化的表现。

基因组比较和核苷酸多态性分析

滑动窗口分析鉴定出6个高变区域：psbA、rbcL-psaI、petA-psbJ、psbE-petL、rpl32-trnL和rpl32，其平均核苷酸多样性(Pi)为0.00438。大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)的核苷酸多样性显著高于反向重复区(IR)，但即使是高变区域也缺乏足够的信息位点来区分冰草属的不同物种。

冰草属系统发育和核苷酸多样性

基于完整叶绿体基因组的最大似然树显示，48份冰草属样本形成一个高支持度的单系群(bootstrap=100)。然而属内种间关系未能解析，5个物种和2个变种均未形成独立的单系群。系统发育分析仅发现178个信息位点，占整个叶绿体基因组有效位点的0.13%。地理来源相近的样本反而倾向于聚在一起，如来自内蒙古多伦县的3份A. mongolicum样本和来自新疆巴里坤的2份A. desertorum样本。

SNP主成分分析

在48份冰草属材料中共鉴定出439个多态位点(364个SNP和75个InDel)，未发现物种特异的SNP或InDel。主成分分析(PCA)显示，前两个主成分(PC1和PC2)分别解释7.7%和7.2%的变异，但不同物种在PCA图上广泛重叠，无法区分。

STRUCTURE分析

基于Angiosperms353标记的STRUCTURE分析表明K=2是最佳分组结果(ΔK=98.14)，但遗传分组与冰草属的传统分类不一致。大多数个体以红色组分为主，仅在AS0202个体中蓝色组分占优势。当K=3和K=4时，遗传组分模式与K=2相似，均不支持当前的分类体系。

研究结论与讨论部分强调，冰草属叶绿体基因组在结构和功能上表现出高度保守性，这种保守性可能源于强烈的纯化选择压力，以维持光合作用功能在温带草原生态系统中的稳定性。丰富的A/T重复序列可能通过影响基因调控区域(如启动子或非编码RNA)在冰草应对蒙古高原强烈的紫外线辐射、季节性干旱和极端温度等胁迫中发挥调节作用。密码子使用偏好A/U结尾的现象可能是冰草的一种生态适应策略，通过提高关键光合膜蛋白的翻译效率，支持其在短暂生长窗口期进行快速生物量积累。

然而，叶绿体基因组变异不足以为冰草属物种划分提供足够信息，这可能源于叶绿体基因组缓慢的突变速率和不完全谱系分选(ILS)现象。研究结果支持冰草属狭义概念(Agropyron s. s.)的单系性，但与冰草属广义概念(Agropyron s. l.)下的传统分类存在显著冲突。未来需要整合核基因组数据，特别是那些能够捕获更快速进化信号的多基因座标记，才能最终解决冰草属的分类学难题。

该研究全面揭示了冰草属植物的叶绿体基因组信息及其在属内的一致性，为禾本科植物的系统进化研究提供了重要基础数据，同时对牧草种质资源鉴定、生态恢复植物选育具有重要指导意义。