综述：解锁微生物潜力：组学和生物信息学在芳香烃降解方面的进展

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Unlocking microbial potential: advances in omics and bioinformatics for aromatic hydrocarbon degradation

本综述系统阐述了芳香烃（AHs）微生物降解的最新研究进展，重点聚焦于组学（基因组学、宏基因组学等）与生物信息学工具如何揭示新的降解途径、酶及微生物多样性。文章详细比较了AHs在有氧、无氧及混合条件下的降解机制（如β-酮己二酸途径、苯甲酰辅酶A途径），并指出未来研究应优先表征新型酶（尤其是介导无氧降解的酶），开发整合更广分类多样性和实验证据的专业数据库，以及将多组学技术、人工智能与生态模型整合到统一分析流程中，以充分释放微生物代谢潜力，指导更有效的生物修复策略。

　　

引言

芳香烃（Aromatic Hydrocarbons, AHs）是一类具有至少一个苯环作为中心结构单元的有机化合物，因其高毒性和持久性而成为重要的环境污染物。它们广泛分为单环芳香烃（MAHs，如BTEX_{苯、甲苯、乙苯、二甲苯}）和多环芳香烃（PAHs，如萘、菲、芘等）。许多AHs及其代谢物被公认为强致癌、致突变和致畸剂，其毒性主要与形成DNA加合物有关。尽管苯环具有高热力学稳定性，但某些细菌进化出了专门的代谢途径，能够利用AHs作为唯一的碳源和能量来源。近年来，测序技术的飞速发展、数据库的扩展以及复杂生物信息学工具的开发，极大地推动了对AHs细菌降解机制的研究。本综述旨在总结当前关于AHs降解途径、酶和微生物多样性的知识，并强调组学和生物信息学方法在揭示新途径、酶和微生物多样性方面的作用，同时指出需要进一步研究的领域。

芳香烃的微生物降解

细菌对AHs的分解代谢，无论在厌氧还是好氧条件下，通常都分为上（或外周）途径和下（或环裂解）途径。上途径将多样的芳香化合物汇集到中心中间体，如儿茶酚、原儿茶酸或苯甲酰辅酶A（benzoyl-CoA）。下途径则使这些中间体脱芳构化并裂解，产生细菌可用于生物量生产的代谢物。

MAHs的好氧分解代谢途径

多种细菌在好氧条件下催化AHs的生物降解，主要包括革兰氏阴性菌属（如假单胞菌属^Pseudomonas、鞘氨醇单胞菌属^Sphingomonas）和革兰氏阳性菌属（如红球菌属^Rhodococcus）。该过程由加氧酶（单加氧酶和双加氧酶）介导，它们利用分子氧（O₂）作为共底物，催化羟基（-OH）并入芳香环。

上途径始于芳香底物的活化，通常由多组分环羟基化双加氧酶（RHDs）催化，产生顺式二氢二醇衍生物，随后氧化为中心中间体，如儿茶酚。这些中间体然后在下途径中通过环裂解双加氧酶（RCDs）进行邻位或间位裂解。邻位裂解发生在两个羟基之间，由内二醇双加氧酶催化；而间位裂解靶向相邻的C-C键，由外二醇双加氧酶（Edos）介导。

虽然间位裂解途径表现出相当大的多样性，但邻位裂解主要局限于中心的β-酮己二酸途径（β-KAP）。该途径具有分别用于儿茶酚和原儿茶酸分解代谢的分支，两者在β-酮己二酸内酯处汇合。β-KAP在细菌中广泛保守，但其调控和基因组织显示出显著的分化。

最近的研究越来越关注RCDs，因为它们在AHs降解过程中决定途径特异性方面起着关键作用。序列和结构分析已识别出三个不相关的外二醇双加氧酶家族：Type-I（例如儿茶酚2,3-双加氧酶）属于邻位氧螯合（VOC）超家族，Type-II属于LigB超家族（例如原儿茶酸4,5-双加氧酶），Type-III酶属于杯状蛋白超家族（例如龙胆酸双加氧酶）。Type-III Edos因其在旁位裂解途径中的作用而日益被认识，这是芳香环裂解的第三条好氧途径。该途径靶向具有对位取向羟基的芳香化合物（例如龙胆酸盐和氢醌）或那些具有邻位羧酸盐或氨基的羟基的化合物（例如水杨酸盐、2-氨基酚）。

MAHs的厌氧分解代谢途径

在缺氧环境中，细菌通过用替代电子受体（如硝酸盐（NO₃^-）、硫酸盐（SO₄^2-）、二氧化碳（CO₂）和三价铁（Fe³⁺））代替O₂来代谢芳香化合物。代表性的厌氧降解AHs的细菌包括反硝化细菌（如芳香贪噬菌^{Thauera aromatica}、伊氏固氮弓菌^{Azoarcus evansii}）、光异养菌（如沼泽红假单胞菌^{Rhodopseudomonas palustris}）和严格厌氧菌（如金属地杆菌^{Geobacter metallireducens}）。与好氧对应物类似，厌氧微生物将AHs汇集到中心中间体，通常是辅酶A（CoA）硫酯形式。

芳环活化已描述了几种生化策略，包括富马酸加成、磷酸化、不依赖O₂的羟基化、甲基化、直接羧化和ATP依赖的CoA连接。相比之下，苯甲酰辅酶A的下游降解途径似乎更为保守。

苯甲酸为研究苯甲酰辅酶A途径提供了模型底物。在上途径中，苯甲酸通过苯甲酸辅酶A连接酶（BCL）活化为苯甲酰辅酶A。该酶属于芳基辅酶A连接酶/合成酶（ACL）家族。在下途径中，苯甲酰辅酶A经过苯甲酰辅酶A还原酶（BCR）催化的还原脱芳构化，产生环己-1,5-二烯-1-羧基辅酶A（二烯酰辅酶A）。该化合物的完全降解随后通过β-氧化样反应进行，产生乙酰辅酶A和CO₂。

虽然类似的BCLs介导苯甲酸的活化，但系统发育研究表明，随后的脱芳构化步骤由两个不同的BCR类催化，表明它们在自然界中具有独立的进化起源。I类BCRs催化ATP依赖的、不可逆的反应，曾被认为仅存在于兼性厌氧菌中。然而，最近的基因组学和生物化学研究揭示了严格厌氧古菌^{Ferroglobus placidus}中存在固氮弓菌型I类BCRs（bzdNOPQ），从而将其分布扩展到兼性细菌之外。相比之下，II类BCRs是ATP非依赖的、可逆的酶，广泛分布于严格厌氧细菌中，如地杆菌属^Geobacter和互养菌属^Syntrophus。尽管存在机制差异，这两类都对氧气极度敏感，这解释了它们为何不存在于好氧生物中。

AHs降解的混合分解代谢途径

第三种降解苯甲酸和其他芳香化合物（如苯乙酸（Phe）和邻氨基苯甲酸）的策略已在有限数量的细菌物种中得到实验证实。这些新途径被称为混合途径，涉及通过CoA硫酯化初始活化芳环，随后进行环氧化和不依赖氧的水解环裂解。

来自伊氏固氮弓菌的box途径是第一个被识别的混合策略。该途径始于苯甲酸通过BCL活化为苯甲酰辅酶A，然后通过多组分单加氧酶BoxAB进行氧依赖性环氧化，随后进行水解环裂解，绕过了好氧降解通常需要的双加氧酶。下游步骤涉及氧化、异构化和羟基化反应，导致可能尚未检测到但很可能是中间体β-酮己二酰辅酶A。

计算机分析显示，box基因存在于许多α-和β-变形菌纲以及一些δ-变形菌纲中。此外，据报道，几种菌株同时拥有经典的厌氧和混合途径用于苯甲酸降解，其表达取决于生长过程中的氧气可用性。利用CoA硫酯作为初始中间体被认为对微需氧和兼性厌氧菌有利，因为它允许它们统一芳香化合物的摄取机制。这在氧气条件波动时尤其有益，因为当氧气水平低于临界阈值时，可以快速且能量高效地在好氧和厌氧降解路线之间切换。

最近，表征ACL酶的兴趣日益增加，因为它们对于产生中心苯甲酰辅酶A中间体至关重要。然而，大多数ACL酶及相关途径的生化数据仍然有限。迄今为止，仅从能够在芳香底物上好氧或厌氧生长的细菌中纯化出少数ACLs。这些酶表现出广泛的底物特异性，识别并活化苯甲酸及其结构类似物（如苯乙酸、2-,3-,和4-氟苯甲酸、2-氨基苯甲酸以及3-和4-羟基苯甲酸）成为相应的CoA硫酯。迄今为止，仅对苯甲酸、苯乙酸、邻氨基苯甲酸和4-氯苯甲酸的CoA连接酶进行了结构和动力学表征，为了解其催化机制和决定底物特异性的关键残基提供了宝贵见解。

PAHs降解的微生物策略

PAHs的降解速率主要受物理化学因素影响，包括芳环数量、温度和水溶性。低分子量（LMW）PAHs更具挥发性和水溶性，更容易被细菌降解，而高分子量（HMW）PAHs由于溶解性低和生物可利用性有限而构成更大挑战。此外，细菌可能缺乏启动这些复杂分子分解所需的特定酶。因此，自然环境中PAHs的完全矿化通常依赖于多种微生物的协同活性。在微生物群落中，真菌和藻类可以启动部分氧化反应，包括通过过氧化物酶或漆酶介导的转化为醌或邻苯二甲酸酯，这增加了原本难降解PAHs的生物可利用性。这些中间体随后可以被细菌通过好氧或厌氧途径代谢，最终导致环裂解和矿化为CO₂。

与单环芳香化合物类似，细菌中PAHs的好氧降解通常始于环羟基化双加氧酶（RHDs）催化的羟基化步骤，产生顺式二氢二醇，然后氧化为儿茶酚。然而，一些分枝杆菌菌株可以通过细胞色素P450单加氧酶活性矿化PAHs，产生反式二氢二醇作为中间体。模型底物（如萘、蒽和菲）的好氧降解已有充分记载。其中表征最完善的系统是恶臭假单胞菌G7（质粒NAH7）中的nah操纵子，它编码将萘转化为水杨酸盐（上途径）并随后转化为丙酮酸和乙醛（下途径）的酶。

虽然真菌和藻类可以有效地好氧氧化PAHs，但细菌在许多自然和污染地点显示出显著的无氧降解PAHs的能力。然而，厌氧PAHs降解的潜在机制仍然知之甚少。迄今为止，厌氧降解已部分阐明了LMW-PAHs，如萘、2-甲基萘和菲。在这些途径中，严格和兼性厌氧菌使用一些针对单环芳烃描述的生化策略启动芳环活化。在硫酸盐还原条件下，2-甲基萘通过富马酸加成活化，类似于厌氧甲苯降解。未取代的PAHs萘和菲通过UbiD样羧化酶羧化为2-萘甲酸/2-菲甲酸，然后通过ACLs形成CoA硫酯。随后的脱芳构化通过ATP非依赖的还原进行，由一类新型的芳基辅酶A还原酶（ACRs）催化。

AHs降解的生物技术潜力

除了扩展生态和生化知识外，阐明AHs降解的微生物途径为生物技术应用提供了新的机会。

实地研究已证明通过生物强化和刺激本地细菌降解者可以增强原位生物修复。恶臭假单胞菌的生物强化增强了序批式反应器中酚类垃圾渗滤液的处理，固定化的假单胞菌属在纤维床生物反应器中去除了受污染地下水中的BTEX。厌氧降解者将其适用性扩展到缺氧场所（例如沉积物、含水层），而菌群可以胜过单一菌株。

烃降解酶也在工业生物催化中找到了应用。例如，苯乙烯单加氧酶已被用于苯乙烯的对映选择性环氧化，以生产（S）-苯乙烯氧化物（一种有价值的药物和香料前体）。甲苯双加氧酶经过工程改造以增强其对大体积和酯功能化芳烃的二羟基化活性。目前，参与中心途径的加氧酶，如儿茶酚1,2-双加氧酶，较少被视为其生态作用，而更多地被视为能够实现工业单体（如己二酸）可再生路线的战略生物催化剂。合成生物学通过将芳香降解酶整合到异源途径中，以驱动增值化合物的可持续生产，进一步扩展了这些酶的用途。

组学驱动的AH降解途径见解

近年来，组学技术和生物信息学工具的整合极大地推动了微生物分解代谢的研究。这一范式转变的关键驱动力是测序技术的进步。测序策略已从早期的化学方法和手动凝胶基技术发展到自动化荧光方法，最终形成现代高通量平台，包括下一代测序（NGS）和长读长技术。这些方法现在促进了微生物基因组的快速、大规模表征，包括未培养或低丰度生物的基因组。同时，多组学数据为基因表达、蛋白质功能和代谢活性提供了互补的见解。目前有几个数据库和预测工具/资源协助处理、整合和解释这些大规模数据集。

如今，序列基因组可用性的增加，结合核心生物信息学工具，如用于快速序列比对的BLAST、用于同源物敏感聚类的MMseqs2、用于从头基序发现的MEME以及用于基于谱的同源性检测的HMMER，使得能够对不同类群中参与AHs降解的先前未表征酶进行功能预测。为了增强这些预测的准确性和可扩展性，由多序列比对和谱隐马尔可夫模型（HMMs）构建的蛋白质家族模型在专门数据库（如Pfam）中进行管理。这些资源作为注释流程（如RAST/RASTtk和eggNOG-mapper-v2）的组成部分，可自动对基因组或宏基因组进行功能注释。通过交叉引用生物化学和酶学数据库（包括KEGG、MetaCyc、BRENDA、UniProt、PDB和PubChem）进一步丰富了此类注释，这些数据库提供了关于酶功能、代谢反应和化学结构的精选见解。

这些资源共同整合了生物化学、酶学和结构信息，使得能够进行准确的功能分配、全基因组范围内候选AHs降解酶的识别，以及从基因组和宏基因组数据重建完整的分解代谢途径。

比较基因组学

比较基因组学是对全基因组序列衍生的生物信息进行系统比较的方法。这种方法支持基因注释、代谢潜力预测以及与AHs降解相关的代谢和调控网络的重建。这些努力导致了编码新型AHs降解酶基因的发现。例如，在脱硫球菌TRIP_1中，研究人员结合MicroScope、KEGG、MetaCyc、CheckM和同源性搜索以及转录组学和蛋白质组学数据，提出了参与菲降解的菲甲酸辅酶A连接酶和UbiD样羧化酶。基于这些预测，后续研究纯化并表征了2-菲甲酸辅酶A连接酶，为其活性提供了生化验证。

更广泛的比较基因组学研究显示了不同细菌中广泛的芳香分解代谢遗传潜力。例如，对贪铜菌JMP134的比较基因组学研究通过基因组测序、计算机注释、基因背景分析和系统发育重建，预测了众多的分解代谢途径。这些预测得到了实验验证，该菌株被证明能在60种芳香底物上生长，通过β-酮己二酸、龙胆酸、尿黑酸、苯乙酰辅酶A和苯甲酰辅酶A途径进行代谢。

基因组分析现在正将这种方法扩展到单生物基因组之外。对80个伯克霍尔德氏菌目基因组的调查，使用BLASTP搜索和48个加氧酶标记的系统发育重建，揭示了几乎所有的中心环裂解途径。最近，对来自污染土壤的22种细菌菌株的基因组测序和注释（RASTtk, DRAM）识别出数百个用于苯甲酸、龙胆酸、尿黑酸、原儿茶酸、BTEX和LMW-PAHs降解的基因。

宏基因组学和宏基因组组装基因组

宏基因组学能够直接从环境DNA研究未培养的微生物，揭示参与AHs生物降解的复杂微生物群落的群落组成和代谢潜力。宏基因组的功能注释通常依赖于优化的比较基因组学工具。针对参考蛋白质数据库（如UniProt和NCBI RefSeq）的超快速同源性搜索通常使用DIAMOND进行，而基于正交关系的工具（如eggNOG-mapper v2）现在已成为环境数据集中大规模功能推断的标准。此外，宏基因组组装基因组（MAGs）的恢复通过组装和分箱从群落数据集中产生近乎完整或草稿级别的基因组。通过MAGs，我们可以更好地了解微生物多样性，重建代谢，并研究自然和污染环境（从深海沉积物到污染土壤）中的AH降解。

案例研究强调了从工具到发现的转变。稳定同位素探测（SIP）结合鸟枪法宏基因组学将未培养的红环菌科鉴定为污染土壤中主要的菲降解者，使得能够克隆具有不同底物特异性的新型RHDs。从炼油厂废水处理厂在氮限制条件下回收的MAGs显示，慢生根瘤菌科编码固氮途径和至少14个用于AH利用的加氧酶。最近，人工智能（AI）引导的宏基因组挖掘结合HMM谱、结构建模和功能验证，发现了同源性搜索遗漏的序列 divergent 的双加氧酶/过氧化物酶。

作为这些发现的自然延伸，专门资源如HADEG、CANT-HYD、RHObase和OxDBase已经出现，以支持烃降解研究。HADEG汇编了参与好氧降解的实验验证基因，作为可靠注释的参考框架。CANT-HYD提供了一套37个HMMs，用于识别和注释参与厌氧和好氧降解的标记基因，使其适用于大规模基因组和宏基因组注释。相比之下，RHObase和OxDBase专注于加氧酶，提供序列、结构和功能信息，以及可直接用于执行功能预测BLAST搜索的数据集。虽然这些资源代表了宝贵的努力，但专门为AHs降解研究设计的生物信息学工具数量仍然非常有限，并且其中大多数专注于好氧过程而非厌氧过程。这凸显了需要解决微生物分解代谢策略全范围的资源。

多组学整合

虽然基因组学和宏基因组学揭示了微生物群落的遗传潜力，但它们只提供了可能功能的静态清单。捕捉决定AHs降解的活跃过程需要额外的组学层面，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学。这些方法使得能够从预测过渡到对原位调控、表达和代谢结果的直接观察。

转录组学描述了特定环境条件下的动态基因表达。例如，RNA-Seq研究显示了当细菌暴露于AHs时，编码RHDs和外周分解代谢酶的基因被诱导，从而验证了从基因组数据得出的预测。此外，转录组谱分析允许发现新的调控因子和转录网络，这些网络根据底物可用性或压力微调分解代谢途径。这种方法在合成生物学背景下也得到了强调，其中转录组学被认为是表征烃响应调控系统并将其重新用作生物传感器的关键步骤。

蛋白质组学通过提供关于酶而非RNA的直接信息来补充转录组学方法。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术已被用于量化降解酶（如加氧酶、CoA连接酶和还原酶）的表达。例如，研究人员使用差异膜蛋白质组学揭示了金属地杆菌中第一个ATP非依赖的II类BCR。类似地，红球菌TFB的蛋白质组谱分析表明特定于邻苯二甲酸酯和萘代谢的酶被诱导，使得能够重建完整的邻苯二甲酸酯降解途径。伯克霍尔德氏菌K24的蛋白质基因组学研究证实了苯胺、苯甲酸和甲苯降解的多个独立途径共存。最近，蛋白质组学调查强调了它们在检测翻译后修饰、酶异构体和意外的代谢相互作用方面的价值，从而提供了一种补充转录组学预测的方法。

代谢组学通过分析小分子和途径中间体增加了下游维度。通过气相色谱-质谱（GC-MS）或核磁共振（NMR）等技术，代谢组学允许检测诊断性中间体。例如，GC-MS已被用于鉴定酚降解过程中的儿茶酚和顺,顺-粘康酸，从而验证酵母细胞中的邻位裂解途径，并检测嗜盐阿罗单胞菌降解苯的初始中间体氘代酚，确认羟基化为入口步骤。使用LC-MS/MS对CoA硫酯进行互补的靶向代谢组学也发现了厌氧降解者中活化的中间体，如卤代苯甲酰辅酶A和苯甲酰辅酶A，为途径变体提供了化学证据。

当整合时，这些组学方法创建了AHs降解的多层系统视图。因此，多组学整合弥合了遗传潜力与实际功能之间的差距。

新兴方法

人工智能（AI）和机器学习（ML）现在通过预测酶功能和代谢潜力来增强功能基因组学。DeepFRI即使在没有可检测同源性的情况下，也能从序列和结构特征推断功能。AntiSMASH和ML分类器已经预测了细菌、真菌和植物基因组中腺苷酸形成酶（ANL）超家族内的生物合成基因簇，该超家族包括对AHs降解至关重要的ACLs。ML分类的ANLs使得能够进行系统发育重建，表明古老的ANLs具有与现代使用CoA-SH作为受体的酶最相似的活性位点。

基因组尺度代谢模型（GEMs）通过BiGG、ModelSEED、MOST和COBRA工具箱将这些预测整合到网络中，使得能够进行计算机通量和途径模拟。例如，使用COBRA对恶臭假单胞菌KT2440的重建使得能够进行通量平衡模拟，验证了甲苯降解的分解代谢途径。类似地，荧光假单胞菌的定制GEM使用RAST和ModelSEED预测了通过β-酮己二酸途径的儿茶酚降解。

尽管其效用日益增长，但基于AI的预测和GEM重建仍然受到注释空白、有偏的训练数据集以及缺乏实验验证的限制。解决这些挑战将需要整合精选的多组学数据、改进建模算法并纳入生化证据，以充分利用它们在阐明AHs降解途径方面的潜力。

局限性、未来展望与结论

组学和生物信息学加深了我们对AHs降解的理解，揭示了新的酶，将已知途径扩展到被忽视的类群，并发现了替代路线。基因组学和宏基因组学现在对于探测未培养和培养微生物共同作用以降解和矿化AHs的生态位至关重要。

尽管有这些进展，我们对关键厌氧步骤的生化理解仍然不完整。例如，提出的厌氧苯羧化酶（UbiD/UbiX型）得到了组学证据的支持，但在生化上仍仅部分解析。同样，硫酸盐还原培养物N47中通过羧化活化萘的机制已被概述，但相应的酶仍在巩固中。对于菲，涉及2-菲甲酸辅酶A连接酶和2-菲甲酰辅酶A还原酶的下游步骤已被定义，但初始活化羧化酶的身份和多样性仍有待完全阐明。这些空白突出了将组学预测与实验验证相结合以揭示环境微生物全部酶潜力的重要性。

AHs研究的另一个关键限制是缺乏用于预测分解代谢基因和酶的专门数据库和工具。现有资源和参考数据库大多局限于好氧途径，专注于加氧酶和其他表征良好的酶（例如OxDBase, RHObase）。因此，关键的厌氧酶（例如芳基辅酶A连接酶、羧化酶、芳基辅酶A还原酶）仍然注释不佳，并且很少被纳入预测工作流程。同时，参考数据集以模型生物（如假单胞菌属和大肠杆菌）为主，使得未培养谱系代表性不足。因此，在MAGs或单细胞基因组中编码的分解代谢策略经常被遗漏，复杂微生物组中的注释可能不完整或有偏差。

最后，另一个挑战是提供AHs降解途径收敛证据的组学层面整合不佳。宏基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学提供了互补的见解，但它们很少被统一到预测框架中。同样，超越同源性的AI方法很少与实验组学或代谢模型相关联，这限制了它们预测 divergent 或表征不佳的酶家族功能的能力。

解决这些局限性将需要协调努力以扩展专门数据库，改进预测框架，并将计算模型更紧密地与生态条件联系起来。进展将取决于纳入从MAGs和单细胞基因组重建的酶，扩展分类学覆盖范围，并丰富分解代谢注释。将基因组尺度代谢模型与考虑氧梯度、营养水平和污染物浓度的生态模拟相结合，可以进一步弥合实验室预测与实地条件之间的差距。这些进展将提高预测准确性，促进关键微生物降解者和酶的发现，并最终释放微生物群落的全部生物修复潜力。