镉暴露下文蛤与四角蛤蜊免疫调节生物标志物响应差异的比较分析及其生物监测意义

本文比较研究了文蛤（Meretrix meretrix）与四角蛤蜊（Mactra veneriformis）在短期水体镉（Cd）暴露下，消化腺和鳃组织中金属硫蛋白（MT）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的响应差异。结果表明，鳃组织因直接接触环境且代谢活跃，其SOD、MT和MDA含量变化显著大于消化腺，对Cd胁迫更敏感，是急性毒性监测的理想靶点。研究为黄河三角洲等区域的Cd生物监测提供了候选指示物种和敏感生物标志物，并为完善生态风险评估提供了理论基础。

　　

1 引言

在环境监测计划中，生物标志物是评估沉积物、水体和生物群中重金属/有机化合物污染及其对水生生态系统相关生物效应的重要指标。多种生物标志物作为污染物暴露的综合衡量指标，可为污染物的毒理学效应提供宝贵见解。因此，针对特定外源物质的一套全面的生物标志物，结合化学分析，可能是监测海洋污染的有效工具。

底栖水生物种，特别是贝类，是海洋环境中的典型指示物种，其某些生理和/或生化参数通常直接影响特定污染物的污染程度。例如，通过滤食性摄食积累高浓度金属的双壳贝类，可以通过不同的生物标志物反映污染物积累的时空格局。在这些生物标志物中，金属硫蛋白（MT）诱导是表明亚致死暴露于镉（Cd）、铜（Cu）、锌（Zn）和铅（Pb）等金属的成熟指标。MTs是多功能蛋白质，参与调节必需金属稳态、参与免疫反应、对抗氧化应激以及介导有毒金属解毒。MT水平升高通常表明金属暴露。对海洋无脊椎动物MT的研究主要集中在双壳类软体动物，如菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）、紫贻贝（Mytilus edulis）、海湾扇贝（Argopecten irradians）、文蛤（Meretrix meretrix）和长牡蛎（Crassostrea gigas），这归因于它们的固着性、低代谢活性和易积累重金属的特性。然而，MT响应因物种、金属类型和环境条件（如季节性波动）而异，这凸显了进行比较研究以验证其特异性和准确性的必要性。

与MT并行，抗氧化系统的关键组成部分——包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）——是广泛用于污染物诱导氧化应激的生物标志物。有机外源物质的代谢通常产生活性氧（ROS），后者会破坏细胞组分、改变基因表达并导致氧化应激。MDA含量反映脂质过氧化水平，常用于贝类和鱼类的毒性评估。因此，抗氧化系统主要功能是消除超氧阴离子（O₂^–）自由基，而脂质过氧化（LPO）水平由MDA含量直接指示。因此，结合抗氧化酶指标和MDA进行研究可以更好地反映机体的抗氧化响应机制。

镉因其在水生生态系统中的毒性和持久性而成为一个主要的环境问题。它在组织中生物积累，刺激ROS产生，诱导氧化生物分子损伤，并促进MT合成。镉还能抑制酶活性、破坏细胞信号传导并扰乱钙稳态。在中国，镉污染是某些水产养殖区的一个重要问题。例如，在贝类资源丰富的黄河三角洲地区，镉浓度有时超过水质标准，威胁具有经济价值的物种。

在黄河三角洲，文蛤（Meretrix meretrix）和四角蛤蜊（Mactra veneriformis）是两种本地、同域分布的蛤类，具有生态和经济价值。两者都对污染物表现出可检测的生化响应，被认为是潜在的指示物种。然而，关于它们对镉胁迫响应的比较分析——特别是在MT诱导、抗氧化活性和氧化损伤方面——仍然有限。

因此，本研究旨在通过量化消化腺和鳃组织中组织特异性镉积累以及一套生物标志物（MT、SOD和MDA），系统比较文蛤和四角蛤蜊对镉胁迫的差异响应。将检查镉积累与生物标志物表达之间的关系，以阐明物种特异性防御机制并增强这些蛤类的生物指示效用。

2 材料与方法

2.1 化学品

纯度≥99%的化学品包括5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和亮抑蛋白酶肽，购自Sigma-Aldrich（中国上海）。其余纯度≥98%的试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.2 蛤类处理

本研究所用文蛤和四角蛤蜊（平均壳长：3.89 ± 0.21 cm）购自位于中国滨州市附近渤海沿岸的无棣县某水产养殖基地。该养殖场获得良好农业规范（GAP）认证。来自该养殖场的海产品定期筛查重金属，确保蛤类中的镉含量低于2.0 mg/kg湿重，从而避免对实验结果产生任何潜在干扰。在实验室中，选择大小均匀的蛤类，并饲养在直接取自渤海湾的自然海水中。海水条件维持在盐度28‰、pH 8.0、温度8–10°C。每天更换三分之一体积的海水。持续充气。本实验使用食品级粉末状钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）作为饲料，其镉含量≤0.2 mg/kg。投喂前，将20 mg藻粉充分重悬于200 mL培养水中。使用移液器按预定间隔将10 mL该藻悬液均匀分配到每个饲养缸中，确保个体摄食量一致。此投喂量中的镉含量极低（≤0.01 μg/L），因此可忽略不计，预计不会影响实验结果。实验前，蛤类在这些条件下适应一周。

2.3 实验设计

适应期后，将蛤类转移到含有海水的塑料缸（50 × 40 × 30 cm）中。盐度（28‰）、pH（8.0）、温度（8–10°C）和投喂方案（粉末状钝顶螺旋藻）保持与适应条件一致。海水中镉的平均浓度为0.219 ± 0.011 ng/L。对于暴露组，将CdCl₂溶解并稀释在海水中，以达到0.05、0.1和0.15 mg/L的名义浓度，分别对应于水产养殖水质标准中镉标准（≤0.005 mg/L）的10倍、20倍和30倍。每个处理，包括对照组，设三个重复缸，每个缸放养40只蛤。每天更换含有相应镉浓度的三分之一体积的海水。每24小时验证一次暴露缸中的镉浓度。在7天的暴露期间，所有浓度下均未观察到死亡。在暴露开始后的第0、1、3、5和7天采集两种物种的消化腺和鳃组织样本。

2.4 样品制备

暴露期后，在冰上解剖蛤类。将每个重复缸中三个个体的消化腺和鳃合并。每个组织样本的一半立即在-80°C下冷冻于1.5 mL离心管中用于MT分析。剩余组织用蒸馏水冲洗，并在冰浴中使用玻璃匀浆器在冷磷酸盐缓冲液（100 mM, pH 7.4）中匀浆（1:10 w/v）。将匀浆液保持在4°C，并在4°C下以3,500 × g离心10分钟。所得上清液分装用于SOD活性和MDA含量分析。

2.5 SOD活性

使用总超氧化物歧化酶测定试剂盒（WST-1法，南京建成生物工程研究所）测量SOD活性。一个SOD活性单位（U）定义为在1 mL反应体积中，每毫克蛋白质使甲臜染料还原反应抑制50%的酶量。活性表示为U/mg/min。

2.6 MDA含量

使用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量，方法改编自Wills (1987)。简言之，将50 μL组织匀浆用蒸馏水稀释至1 mL。随后加入500 μL冰冷的20%三氯乙酸（含1 mM FeSO₄）和1 mL 0.67% (w/v) TBA溶液。涡旋混合样品，并在90°C孵育10分钟以形成MDA-TBA加合物。冰上冷却后，通过离心（3,000 × g, 5分钟, 4°C）去除沉淀。取1 mL上清液用蒸馏水按1:3稀释，并使用分光光度计在532 nm处测量吸光度。MDA浓度根据1,1,3,3-四甲氧基丙烷生成的标准曲线计算，并归一化至蛋白质含量，表示为nmol MDA/mg蛋白质。

2.7 MT定量

使用改良的Viarengo等人(1997)方案测定MT含量。将冷冻组织在冰冷缓冲液[100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0），0.5 M蔗糖，20 mM Tris-HCl（pH 8.6），0.006 mM亮抑蛋白酶肽，0.5 mM PMSF，0.01% (v/v) β-巯基乙醇]中匀浆（1:3 w/w）。将匀浆液离心（30,000 × g, 20分钟, 4°C）。使用乙醇-氯仿（1.005:0.08 v/v）从上清液中沉淀高分子量蛋白质，并通过离心（7,000 × g, 10分钟, 4°C）收集沉淀。将含MT的上清液与1 mg RNA、40 μL 37% HCl和6 mL乙醇在-20°C孵育1小时。通过离心（2,000 × g, 15分钟, 4°C）沉淀MTs，用蔗糖-Tris/乙醇/氯仿（13:87:1）洗涤两次，并空气干燥。将沉淀溶解在150 μL 0.25 M NaCl和150 μL 4 mM HCl-EDTA中。使用Ellman试剂[5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸), DTNB]在412 nm处（BioTEK ELx800）分光光度法测定MT浓度。使用还原型谷胱甘肽标准品进行校准。基于半胱氨酸反应性（每个分子21个残基，分子量~8.6 kDa）计算MT含量，并表示为μg MT样蛋白/mg总蛋白。

2.8 蛋白质测定

使用Bradford (1976)方法（Bio-Rad蛋白质测定试剂盒）以牛血清白蛋白为标准品测定酶提取物中的可溶性蛋白质浓度。在595 nm处测量考马斯亮蓝G-250染料-蛋白质复合物的吸光度。

2.9 统计分析

使用SPSS 19.0进行数据分析，结果表示为平均值±标准差（SD）。在验证正态性（Shapiro–Wilk检验）和方差齐性（Levene检验）后，首先使用单因素方差分析确定组间总体显著性。当方差分析表明存在显著性时，按如下方式应用事后检验：Dunnett检验专门用于每个暴露组与对照组之间的比较，而不同暴露浓度之间的两两比较则使用Duncan检验（方差齐时）或Games–Howell检验（方差不齐时）进行。所有分析采用统一的显著性阈值P < 0.05。

3 结果

3.1 镉暴露下文蛤和四角蛤蜊组织中SOD活性的响应

图1显示了文蛤的SOD活性。在消化腺中，0.05 mg/L镉暴露的SOD活性与对照组相比无显著差异。相反，0.10 mg/L组的SOD活性从第3天开始显著增加（P < 0.05），并在第7天达到峰值。而0.15 mg/L组的SOD活性在第5天达到峰值，超过110 U/mg prot。如图1B所示，在鳃中，0.05 mg/L镉组的SOD活性从第3天开始显著高于对照组，并保持上升趋势。而0.1 mg/L镉组和0.15 mg/L镉组的SOD活性分别在第1天就显著高于对照组，并分别在第5天和第3天达到峰值。在0.15 mg/L镉组中发现SOD活性显著降低（P < 0.05）。

至于四角蛤蜊，消化腺中的SOD活性在暴露于0.05 mg/L镉时从第3天起超过对照组并持续上升。而0.10 mg/L组显示早期激活（第1天），在第3天达到峰值，并在第7天下降至接近对照组水平。在高浓度组（0.15 mg/L），SOD活性在第3天达到峰值，然后下降，并在第7天低于对照组。鳃SOD活性显示出不同的响应：0.05 mg/L组从第1天开始稳定增加；0.10 mg/L组的SOD活性在第1天急剧达到峰值（46.95 U/mg）并持续下降，从第5天开始低于对照组；0.15 mg/L组的SOD活性从第1天开始持续受到抑制。

比较分析表明，两种物种的鳃SOD活性比消化腺经历了更显著和敏感的波动。四角蛤蜊在同源组织中表现出比文蛤更大的SOD变异性。从机制上讲，低浓度镉（0.05 mg/L）暴露普遍增强了SOD活性，而较高镉浓度（≥0.10 mg/L）则诱导了抑制。

3.2 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊组织中MT含量的影响

图3描绘了文蛤的MT含量。对于0.05 mg/L镉暴露，消化腺中未观察到MT含量的显著变化，而从第3天开始观察到MT含量显著增加（P < 0.05），并持续保持上升趋势。而在0.10 mg/L镉暴露下，两种组织中的MT含量从第1天开始均表现出显著升高（P < 0.05），分别在第7天（消化腺）和第5天（鳃）达到极值（P < 0.05）。在暴露于0.15 mg/L镉时，MT含量从第3天（消化腺）和第1天（鳃）开始极显著上升（P < 0.05）。总体而言，文蛤的MT积累显示出剂量和时间依赖性，鳃中的MT积累表现出更强的响应性和更陡峭的增加。

图4展示了四角蛤蜊的MT含量。消化腺中的MT含量在0.05 mg/L镉暴露下从第3天开始显著增加（P < 0.05）。对于0.10 mg/L和0.15 mg/L组，MT含量从第1天开始就显著高于对照组（P < 0.05），并分别在第5天和第1天达到极显著更高（P < 0.05）。对于鳃中的MT含量，在0.05 mg/L镉暴露下，分别在第1天和第5天首次观察到显著和极显著增加（P < 0.05），而在0.10 mg/L和0.15 mg/L组中，极显著增加均发生在第1天（P < 0.05）。值得注意的是，在相同浓度下，鳃比消化腺表现出更早和更显著的MT上调。

比较分析揭示了两种物种中保守的剂量和时间依赖性MT积累，符合经典的剂量-反应关系。然而，四角蛤蜊在两种组织中表现出显著强于文蛤的MT诱导（鳃：峰值高2.1倍；消化腺：高1.8倍），表明对镉胁迫的敏感性更高。

3.3 镉暴露对文蛤和四角蛤蜊MDA含量的影响

图5说明了文蛤的MDA含量。在消化腺中，MDA含量在0.05 mg/L镉暴露下保持稳定，但在0.10 mg/L和0.15 mg/L镉组中分别从第3天和第1天开始显著增加（P < 0.05）。鳃丝从第3天（0.05 mg/L）、第1天（0.10 mg/L）和第1天（0.15 mg/L）镉组开始表现出显著的MDA升高（P < 0.05）。对照组鳃的基线MDA含量低于消化腺（P < 0.05）。关键的是，一旦暴露于镉，在所有处理中，鳃的MDA诱导均显著大于消化腺（P < 0.05），表明鳃的敏感性更高。

图6展示了四角蛤蜊的MDA含量。消化腺MDA分别从第3天（P < 0.05）、第1天（P < 0.05）和第1天（P < 0.05）开始针对0.05、0.10和0.15 mg/L镉组显著增加。而鳃丝中的MDA在0.05 mg/L组第1天开始显示显著增加（P < 0.05），在0.10和0.15 mg/L镉组第1天均显示极显著上升（P < 0.05）。MDA诱导的幅度在鳃中 consistently 大于消化腺。

比较分析显示，在相同镉浓度下，四角蛤蜊在同源组织中的MDA响应显著强于文蛤（鳃：高1.7倍；消化腺：高1.4倍；P < 0.05）。大多数处理表现出时间渐进性的MDA积累，符合剂量/时间依赖性氧化损伤机制。

4 讨论

4.1 文蛤和四角蛤蜊对镉暴露的免疫调节生物标志物响应

镉通过多种途径对水生生物产生毒性，包括破坏抗氧化防御、诱导脂质过氧化以及激活金属硫蛋白（MT）合成。在本研究中，文蛤消化腺中的SOD活性在低镉暴露（0.05 mg/L）下保持不变，而鳃SOD从第3天开始显著增加，表明直接暴露于环境的鳃对镉诱导的氧化应激更敏感。类似地，四角蛤蜊在0.05 mg/L镉下从第1天开始就表现出快速的鳃SOD激活。在较高镉水平（≥0.10 mg/L）下，两种物种都显示出双相的“诱导-抑制”模式，尽管文蛤的峰值出现时间（第3-5天）晚于四角蛤蜊（第1-3天）。四角蛤蜊的这种较早饱和可能与其较高的代谢率以及随之而来的鳃组织中ROS快速积累有关。

MT在两种物种中均表现出剂量和时间依赖性诱导，尽管四角蛤蜊显示出更强的上调——例如，鳃MT在0.15 mg/L镉下早在第1天就显著增加。这可能反映了物种特异性特征，如更大的鳃表面积和更高的镉吸收率，需要快速合成MT以进行金属隔离。在所有浓度下，鳃MT的响应均早于消化腺MT，强化了鳃作为哨兵器官的作用。值得注意的是，MT诱导并非持续性的：在0.15 mg/L镉下，四角蛤蜊的鳃MT到第7天趋于稳定，表明金属结合能力饱和或应激反应通路发生转变，这与报道的该物种在高镉负荷下进行性DNA损伤一致。

MDA作为脂质过氧化的终产物，在文蛤鳃组织中0.05 mg/L镉下第3天开始显著上升，而消化腺MDA仅在≥0.10 mg/L时增加，再次突出了鳃的易感性。四角蛤蜊显示出更放大的MDA响应：鳃MDA在0.05 mg/L下从第1天开始激增，在相同剂量下的增量高于文蛤。这些结果与我们之前的发现一致。时间相关性分析显示，MDA积累与SOD崩溃同时发生——例如，在文蛤鳃中0.15 mg/L时，SOD在第7天急剧下降，而MDA达到峰值，表明抗氧化系统失效。类似地，在四角蛤蜊鳃中0.10 mg/L时，当SOD降至基线以下时，MDA在第5天超过对照组，证实了ROS的压倒性优势。因此，整合SOD和MDA动态阐明了镉诱导氧化损伤的种间差异。

4.2 文蛤和四角蛤蜊镉响应机制的比较分析

表1总结了两物种之间的关键差异响应。综合分析表明四角蛤蜊对镉更敏感，表现为：（1）更早的生物标志物激活（例如，鳃SOD在0.05 mg/L下第1天升高）；（2）高镉下峰值后下降更快（例如，鳃SOD在0.15 mg/L下第7天低于对照组）；（3）更大的氧化损伤（更高的MDA增量）。这些发现与早期关于镉诱导四角蛤蜊行为和血细胞变化的报道一致，支持其作为沿海镉生物指示剂的潜力。

首先，差异敏感性源于生理和生态适应。四角蛤蜊具有更大的鳃表面积，增强了镉吸收，但伴随着较低的抗氧化能力，导致更早的氧化损伤。相比之下，文蛤表现出较慢但持续的MT合成，有利于逐步解毒。在生态上，文蛤的潮间带栖息地可能选择了强大的抗氧化系统，而潮下带的四角蛤蜊对急性污染的适应能力可能较差。转录组分析揭示了文蛤幼虫在镉胁迫下发育阶段特异性的基因调控。后期阶段CCO、Ndh和pro-C3的上调与早期发育阶段HPX和A2M的诱导形成对比。值得注意的是，这些基因在变态过程中显示出逐渐下调，表明镉介导的线粒体电子传递和免疫调节破坏。四角蛤蜊的遗传响应尚未得到广泛研究。然而，血细胞功能实验表明，镉暴露在该物种中诱导了更快的ROS生成速率和更早的DNA损伤发生，表明其分子调控网络可能表现出对镉干扰的高度易感性。

此外，组织特异性调控机制在两种双壳贝类之间有所不同。在文蛤中，MT表达在不同组织间显示出浓度依赖性变异，表明不同的解毒策略：鳃优先进行快速镉隔离，而消化腺通过平衡的MT表达维持稳态。净化后分析进一步表明其恢复能力，卵巢组织中镉水平和氧化应激标志物降低，同时凋亡相关基因下调。相比之下，四角蛤蜊的修复机制仍不清楚，可能是由于镉诱导的细胞恢复过程受到抑制。血细胞响应也存在种间差异——文蛤表现出更大的膜稳定性和更有效的DNA修复。在行为上，文蛤在镉胁迫下显示出对滤水率的优先抑制超过呼吸率，这种现象与谷胱甘肽S-转移酶动态有关——最初增强以解毒脂质过氧化产物，随后在高镉下迅速抑制，导致摄食活动受抑制。

本研究中的相关性分析阐明了镉胁迫下的差异响应机制。在低暴露（0.05 mg/L）下，SOD和MT的协同上升抑制了鳃中MDA的积累直至第3天。在高镉（≥0.10 mg/L）下，SOD崩溃结合MT饱和导致MDA急剧增加。直接暴露且代谢活跃的鳃表现出急性敏感性，而消化腺表现出延迟但持续的响应，可能是由于镉的重新分布和长期解毒需求。定量评估显示敏感性顺序为鳃MDA > 鳃SOD > 鳃MT，其中四角蛤蜊的鳃MDA在0.05 mg/L镉下从第1天开始显著增加。在稳定性方面，MT > MDA > SOD，因为MT持续上升而SOD波动显著。这些不同的模式强调了镉胁迫下生物标志物行为的时间和机制分歧。这些来自短期（7天）暴露的研究结果提出了以下污染监测的生物标志物选择标准：四角蛤蜊的鳃MDA是急性应激的 optimal 早期预警指标，因其快速响应和高敏感性。尽管本研究设计是急性实验，但文蛤消化腺MT的响应模式表明它可能是监测慢性暴露的有希望的候选者；然而，这需要通过更长期的研究来验证。

虽然本研究阐明了这些双壳贝类对镉的差异生理响应，但应注意两个局限性：（1）本研究未测量组织特异性镉积累。虽然生物标志物响应与已知的镉毒性机制一致，但缺乏内暴露剂量数据意味着机制解释仍然是关联性的。未来结合组织负荷分析的研究对于将生物标志物响应与内暴露镉剂量 conclusively 联系起来是必要的。（2）辅助抗氧化酶（如CAT、GPx）的协同作用仍未检验。此外，超过7天的慢性效应需要额外的验证。总的来说，镉暴露通过抗氧化破坏、脂质过氧化和MT通路激活损害两种物种。这些发现推进了沿海镉生物监测的理论框架，并强调需要将组织特异性生物标志物与长期暴露研究相结合以完善生态风险评估。

5 结论

本研究证明了四角蛤蜊和文蛤在短期（7天）镉暴露下表现出不同的毒性响应。由于直接接触污染物且代谢活性高，鳃组织比消化腺表现出更高的敏感性，这反映在生物标志物SOD、MT和MDA上。这些发现支持在类似暴露条件下使用鳃组织作为急性毒性监测的合适靶点。四角蛤蜊对急性镉胁迫表现出更快、更显著的生物标志物响应；然而，其解毒能力（例如MT合成）似乎更容易饱和，表明在持续暴露下不可逆损伤的阈值较低。相比之下，文蛤表现出更渐进的生理调整，表明在急性暴露期内具有 potentially 更高的耐受性。MDA作为脂质过氧化的终产物，即使在低镉浓度下也在鳃组织中表现出早期且显著的升高。这种模式支持其作为短期暴露情景下镉诱导氧化损伤的敏感生物标志物用于早期预警。应注意，7天的暴露设计限制了对慢性监测应用的推断。虽然此处观察到的差异响应暗示了物种特异性在长期生物监测中的潜在优势，但此类结论需要通过延长暴露时间的研究来验证。