柳树水通道蛋白SmPIP1;3的异源表达显著增强植物对非生物胁迫的广谱抗性

本研究系统鉴定了柳树(Salix matsudana)质膜内在蛋白(PIP)基因SmPIP1;3，其异源表达通过维持生理稳态和限制膜损伤，显著提高了转基因烟草对盐、旱、冷、热胁迫的耐受性，为植物抗逆分子育种提供了宝贵基因资源。

　　

引言

水分吸收和跨膜水运输是植物生长发育的基本生理过程，也是植物适应非生物胁迫的关键调控途径。质膜内在蛋白(Plasma Membrane Intrinsic Proteins, PIPs)作为水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)的一个重要亚家族，通过其动态的门控机制参与植物生长和胁迫适应。然而，由于PIPs的功能多效性和对不同环境刺激的整合响应，阐明单个异构体的具体作用仍然具有挑战性。柳树(Salix matsudana)是一种重要的造林和工业用材树种。前期转录组分析发现，在耐盐柳树品种9901中，SmPIP1;3基因的表达受盐胁迫诱导。本研究旨在表征SmPIP1;3基因，阐明其进化特征，并通过遗传转化评估其在植物生长和环境胁迫抗性中的功能作用。

材料与方法

研究以耐盐柳树品种9901为材料。取插条栽培于沙土中，生长一个月后，用200 mmol/L NaCl溶液进行盐处理，分别于0小时和24小时采集叶片和根部样品用于RNA提取。利用基因特异性引物通过qRT-PCR分析SmPIP1;3的表达模式。基于柳树基因组数据，设计引物克隆SmPIP1;3基因全长，并连接到pGEM-T easy载体中进行测序。通过生物信息学工具分析SmPIP1;3蛋白的理化性质、磷酸化位点、跨膜结构域和系统进化关系。将SmPIP1;3基因构建到植物表达载体pEZR(K)-LC中，通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法导入烟草(Nicotiana tabacum)，获得过表达SmPIP1;3的转基因烟草株系。在正常条件以及盐(200 mmol/L NaCl)、干旱、冷(4°C)、热(42°C)胁迫下，比较转基因烟草和野生型(WT)烟草的生长形态，并通过伊文思蓝(Evans blue)染色、相对电解质渗漏率(Relative Electrolyte Leakage, REL)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量等生理指标评估其胁迫耐受性。数据统计分析采用SPSS 23.0软件进行。

结果

SmPIP1;3在柳树中的表达模式

在对照条件下，SmPIP1;3转录本在叶片和根部表达水平相当。当受到盐胁迫时，叶片和根部组织中SmPIP1;3的转录丰度分别显著增加了1.30倍和1.33倍以上。这表明SmPIP1;3可能参与了柳树的盐胁迫抵抗过程。

SmPIP1;3的特性表征

从柳树cDNA中克隆的SmPIP1;3基因全长867 bp，编码288个氨基酸。氨基酸组成分析显示，甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和异亮氨酸(Ile)在SmPIP1;3中含量丰富。对PIP功能至关重要的丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)分别占4.5%和2.8%。预测的SmPIP1;3蛋白分子量为30.73 kDa，等电点为8.99，脂肪族指数为96.25，总平均亲水性为0.374，不稳定指数为25.07，表明它是一种碱性、中度疏水、热稳定且整体稳定的蛋白质。

磷酸化是调节植物质膜AQP活性的重要门控机制。在SmPIP1;3中预测了19个潜在的磷酸化位点，包括7个丝氨酸(Ser)残基、3个酪氨酸(Tyr)残基和9个苏氨酸(Thr)残基，这些位点在蛋白质序列中随机分布。

序列比对显示PIPs具有高度保守性。SmPIP1;3与毛果杨(Populus trichocarpa)的PtPIP1;3序列同一性最高，达到98.61%。系统进化树分析表明，SmPIP1;3与PtPIP1;3紧密聚类，两者均属于杨柳科(Salicaceae)，而与其他科的物种亲缘关系较远。所有PIP1;3蛋白聚为一类，并与PIP1亚家族的其他成员如PIP1;1、PIP1;2等分开，表明每个PIP1亚家族具有独立的进化特征。

二级结构预测显示SmPIP1;3主要包含48.61%的无规则卷曲，以及28.82%的α-螺旋、19.79%的延伸链和2.78%的β-转角。蛋白质结构域分析进一步揭示SmPIP1;3是一个典型的PIP1水通道蛋白，包含六个跨膜结构域和五个螺旋间环。每个α-螺旋两侧与膜内连接环和膜外连接环相关联，形成沙漏状和旋转对称结构。跨膜α-螺旋并非平行排列，而是以25°至40°的角度交错，形成连接细胞内外部的结构。

SmPIP1;3对植物生长的影响

成功将SmPIP1;3基因导入烟草，获得了三个独立的过表达株系(L1, L2, L3)。在正常条件下，转基因株系的株高在3.0至3.8厘米之间，显著高于野生型(2.6厘米)。同时，转基因植物的叶长和叶宽平均分别比野生型增加了1.15倍和1.16倍。转基因植物的根长在11.5至12.3厘米之间，比野生型增加了1.44至1.54倍，但根的数量与野生型相似。此外，转基因植物的平均鲜重和干重分别为1.43克和0.05克，分别是野生型的1.70倍和2.30倍。这些结果综合表明，SmPIP1;3的过表达显著促进了植物的生长。

SmPIP1;3增强植物对非生物胁迫的抗性

在正常生长条件下，转基因和野生型烟草幼苗均生长良好，没有明显的形态异常。当暴露于胁迫条件时，野生型烟草植株表现出严重的胁迫症状，包括叶片萎蔫、失绿和膨压丧失，而转基因植株的表现则好得多。伊文思蓝染色实验显示，在对照条件下没有背景信号；然而，在胁迫条件下，出现了一些散布的蓝色斑点。与野生型相比，转基因株系的染色较少，尤其是在盐胁迫下，表明细胞损伤减轻。

生理指标测量进一步支持了这些观察结果。在正常条件下，转基因植物和野生型植物之间没有检测到显著差异，但在胁迫下出现了明显差异。在盐、旱、冷、热胁迫下，转基因植物的MDA含量分别比野生型降低了1.48倍、1.47倍、1.57倍和1.62倍。同样，在相同胁迫下，转基因植物的REL值比野生型分别降低了1.56倍、1.35倍、1.53倍和1.61倍。显然，SmPIP1;3的过表达有效改善了植物的生理状态，增强了其对多种胁迫的耐受性。

讨论

PIPs广泛参与环境胁迫抗性

作为跨膜水通量的关键调节因子，PIPs在植物适应环境挑战中扮演着至关重要的角色。该水通道蛋白家族成员不仅显著增强双向膜水渗透性，还促进甘油、尿素、类金属、CO₂和H₂O₂的运输，维持水分稳态，从而建立非生物胁迫耐受的基本适应机制。盐、旱、冷等非生物胁迫差异性地调节PIP基因的表达谱。在本研究中，观察到在200 mmol/L盐胁迫后，耐盐柳树种品的叶片和根部组织中SmPIP1;3转录本被显著诱导。这些胁迫诱导的PIP亚型表达模式变化表明了它们在非生物胁迫期间维持水分平衡的适应性调控机制。

利用转基因方法进行的全面功能研究，为PIPs介导植物非生物胁迫响应的关键作用提供了有力证据。例如，本研究显示，在转基因烟草中过表达SmPIP1;3，在正常条件下增强了生长，包括更高的株高、更大的叶片、更长的根和增加的生物量。值得注意的是，这些株系在遭受盐、旱、冷、热挑战时表现出强大的多重胁迫耐受性，量化指标显示其膜损伤指标显著低于野生型对照。

这些发现凸显了PIP水通道蛋白作为非生物胁迫响应的主要调节因子的功能，其作用机制包括维持膜完整性、促进渗透调节和推动胁迫适应性生长。

SmPIP1;3表现出针对多种胁迫的多效性

植物的非生物胁迫耐受性依赖于复杂的分子网络，其中不同基因通过不同的机制发挥作用。例如，扩张蛋白基因已被证明可以松弛细胞壁成分并缓解胁迫。柳树扩张蛋白基因SmEXPA23在烟草中的过表达，在盐胁迫下使REL和MDA含量分别比野生型植物降低了9.87%和19.26%。PIPs则构成了一种有效的基因资源，可以通过改善细胞膜的水通道来促进胁迫抗性。在本研究中，SmPIP1;3在烟草中的过表达减轻了盐、旱、冷或热胁迫引起的损伤：与野生型相比，REL值分别下降了1.56倍、1.35倍、1.53倍和1.61倍，MDA含量分别下降了1.48倍、1.47倍、1.57倍和1.62倍，同时伊文思蓝染色减少，表明细胞损伤减轻。

尽管多效性基因很常见，但它们的胁迫谱和作用方向差异显著。例如，毛白杨的PttEXPA8导入烟草后提高了植物对旱、热、冷的抗性，但对盐和镉胁迫抗性没有显著贡献。棉花GhWRKY25提高了耐盐性但降低了抗旱性。而SmPIP1;3对所有四种测试胁迫都具有广谱抗性，这使其成为分子育种中更具通用性的候选基因。这些多机制基因的协同潜力值得进一步探索。

PIPs的功能取决于其序列和结构

大量研究表明，AQP活性受磷酸化调控，这可能影响AQP通过分泌途径运输至质膜或孔道的开闭。特别是PIP的N端或C端区域内丝氨酸残基的磷酸化受到更密切的关注，并被认为是蛋白质功能的关键。例如，菠菜SoPIP2;1在S115、S188和S274的磷酸化促进了导水孔的扩张。在小麦中，TaPIP2;10在S280磷酸化促进了CO₂向细胞内的运输，从而增强了光合作用并提高了产量，而同一蛋白在S121磷酸化则与H₂O₂向细胞质内的运输有关。一些突变实验也证实了丝氨酸磷酸化的作用。在本研究中，确定了SmPIP1;3中的19个磷酸化位点。对SmPIP1;3和七个物种的PIPs进行序列比对显示，其中大多数是保守的。进一步探索SmPIP1;3中氨基酸磷酸化的变化，对于更好地理解水通道活性如何响应各种生长条件至关重要。

环的特征也被认为是PIP通道功能的重要因素。一项研究揭示，C环残基有助于溶质运输的选择性。我们比较了PIP1蛋白的残基，发现C环含有大量甘氨酸残基，表明这些PIP1是更具灵活性的成员。七个物种间PIP1;3的序列比对也显示出C环比其他环具有更多的多态性。这些表现可能支持PIP1;3针对各种环境胁迫（如所运输的溶质）的多样性。未来对C环及其他结构域的更多研究关注对于基因修饰和分子育种计划至关重要。