靶向TSPAN33的B细胞耗竭策略：基于凝集素芯片筛选桥本甲状腺炎治疗新靶点

本综述创新性地采用凝集素芯片技术筛选桥本甲状腺炎（HT）患者B细胞表面特异性糖基化标志物，成功鉴定出跨膜蛋白TSPAN33作为潜在治疗靶点。研究通过SELEX技术筛选获得高亲和力DNA适配体（Aptamer），并将其与利妥昔单抗（Rituximab）偶联构建双特异性复合物，为实现选择性B细胞耗竭提供了精准治疗新策略。

　　

1 引言

桥本甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis, HT）作为最常见的器官特异性自身免疫疾病，全球患病率高达5%，且具有显著的女性易感性。该疾病的核心发病机制在于免疫系统对甲状腺自身抗原的耐受性被破坏，导致淋巴细胞浸润、抗体介导的组织损伤以及进行性甲状腺功能减退。虽然左甲状腺素替代疗法能够有效纠正激素缺乏，但无法干预自身免疫病理过程。因此，临床亟需能够选择性清除致病性B细胞亚群、同时保留整体体液免疫功能的治疗策略。

CD20导向的单克隆抗体（如利妥昔单抗）可实现广泛的B细胞耗竭，并在HT中显示出短期疗效。然而，非选择性B细胞清除同时会消除调节性B细胞（Bregs）和长寿命浆细胞，可能增加感染风险且难以诱导持续临床缓解。针对病理活化B细胞的靶向治疗策略成为合理的治疗优化方向。

B细胞表面糖基化模式与活化状态及抗原暴露密切相关。本研究提出假说：HT致病性B细胞上富集异常糖基化的膜蛋白，可作为选择性清除的鉴别靶点。为此，研究采用包含38种凝集素的芯片技术，对比分析HT患者与健康对照（HC）的B细胞膜糖组学特征。在差异表达的糖蛋白中，四跨膜蛋白33（Tetraspanin-33, TSPAN33）被鉴定为在活化B细胞和部分淋巴瘤细胞上选择性上调、而在初始和记忆B细胞亚群表达有限的候选靶点。

研究进一步通过SELEX技术筛选获得靶向TSPAN33的高亲和力DNA适配体，并利用双马来酰亚胺连接剂将其与利妥昔单抗偶联。最终评估了人工构建的双特异性复合物对异常增殖TSPAN33⁺⁺B细胞的特异性结合能力。

2 材料与方法

2.1 材料

本研究使用的主要材料和试剂包括：人外周血单个核细胞（PBMC）分离培养基（上海新凡生物技术有限公司）、CD19⁺B细胞分离试剂盒（厦门三益造血技术有限公司）。38种凝集素的糖基化结合特异性信息详见表1，芯片布局见图1A。补体血清（上海远夜生物技术有限公司）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、预染蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific公司）。实验所用B淋巴细胞来源于32例HT患者和40例年龄性别匹配的健康对照外周血样本。

2.2 方法

2.2.1 细胞膜蛋白提取

采用密度梯度离心法分离PBMC，通过抗CD19磁珠分选获得B淋巴细胞。使用细胞膜蛋白提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific）制备高纯度膜蛋白样品。

2.2.2 膜蛋白荧光标记与纯化

采用Bradford法测定蛋白浓度，NHS-Cy3进行荧光标记，反应终止后经Sephadex G-25凝胶柱纯化，重新测定浓度评估标记效率。

2.2.3 凝集素芯片制备与检测

将38种凝集素工作液点样于环氧基化微阵列芯片，封闭处理后与荧光标记的B细胞膜蛋白孵育。采用微阵列扫描仪（北京博奥生物有限公司）检测荧光强度。

2.2.4 差异糖基化膜蛋白富集鉴定

利用凝集素偶联琼脂糖珠富集差异表达糖蛋白，SDS-PAGE分离后通过肽质量指纹图谱进行蛋白鉴定。

2.2.5 差异膜蛋白纯化与适配体筛选

基于质谱鉴定结果，设计引物表达靶蛋白，采用含52个随机核苷酸（N52）的适配体库进行SELEX筛选。经过12轮正向选择和6轮负向选择，通过酶联寡核苷酸 assay（ELONA）评估适配体结合特性，激光共聚焦显微镜分析其与BALL-1细胞系的结合特异性。

2.2.6 适配体-抗体偶联

合成3'-巯基修饰的适配体，与马来酰亚胺化的利妥昔单抗在PBS缓冲液中反应，通过高效液相色谱（HPLC）纯化获得偶联复合物。

3 结果

3.1 凝集素芯片制备

38种凝集素工作液按图1所示布局点样，芯片设计包含4列10行，左首行为牛血清白蛋白阴性对照，右末行为标记点，其余为38种凝集素测试点（每个凝集素设3个重复点）。

3.2 HT患者样本的凝集素芯片检测

芯片检测显示HT组B细胞膜蛋白和血浆蛋白来源的糖蛋白复合物荧光强度显著高于HC组（图1B）。热图分析表明DSA、LTL、GNA、MAL-II和PHA-E等凝集素在HT组膜蛋白中结合信号增强（图1C）。特别值得注意的是，MAL-II和PHA-E在HT组B细胞膜和血浆糖蛋白中均显示结合增强，而PTL-I结合强度降低（图1D, E）。

3.3 差异表达糖蛋白鉴定

通过MAL-II、PHA-E和PTL-I三种凝集素亲和富集糖蛋白复合物，SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色显示差异条带（图2A, B）。质谱鉴定发现唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素9（SIGLEC9）、CD47和TSPAN33等分子在HT组B细胞膜上显著过表达（表2）。

3.4 TSPAN33蛋白克隆表达构建

TSPAN33作为四跨膜蛋白（283个氨基酸），主要定位于异常活化B细胞膜表面（图2C）。通过特异性引物PCR扩增TSPAN33基因（图2D），IPTG诱导表达约36 kDa重组蛋白（图2E）。His标签亲和纯化后，肽质量指纹图谱鉴定6个主要肽段与TSPAN33匹配度超过99%（表3）。

3.5 TSPAN33靶向适配体筛选

经过12轮正向选择和6轮负向选择，第11轮和第12轮库结合亲和力无显著差异（图3A）。将第11轮适配体库克隆至pUC19载体，随机挑选50个单克隆通过ELONA评估结合亲和力。其中适配体11、22、27和40超过设定阈值（图3B）。二级结构预测显示这些适配体形成特征性茎环结构（图3C）。

3.6 适配体特性检测

竞争性ELONA提示适配体27和40可能识别相同或重叠表位（图4A）。四者结合亲和力均达10^-8 M水平，其中适配体40亲和力最高（图4B）。激光共聚焦显微镜证实FAM标记的适配体40特异性结合B细胞表面TSPAN33（图4C）。免疫组化分析显示该适配体可检测HT患者甲状腺浸润B细胞中TSPAN33表达（图4D）。

3.7 适配体-单抗偶联特性检测

采用双马来酰亚胺交联法构建适配体-抗体偶联物（图5A）。HPLC分析显示3.196分钟、8.726分钟、10.093分钟和13.682分钟四个特征峰，表明核酸-蛋白复合物形成（图5B）。纯化后产物在3.191分钟呈现单一峰，证实成功获得偶联复合物（图5C）。

4 讨论

本研究证明膜糖蛋白分析结合适配体靶向技术可有效鉴定HT致病性B细胞特异性表达的治疗靶点。凝集素芯片筛选显示HT患者B细胞上高甘露糖和α2-3唾液酸化聚糖显著富集。通过MAL-II和PHA-E凝集素捕获的糖蛋白质谱鉴定出TSPAN33、CD47和Siglec-9等差异表达表面蛋白。

选择TSPAN33进行深入研究基于以下考量：其log₂差异表达倍数较CD47高2.1倍；携带MAL-II和PHA-E识别的复杂N-聚糖；表达局限于活化和恶性B细胞。在14种MAL-II和PHA-E富集糖蛋白中，TSPAN33差异表达最显著（log₂FC=2.8, q<0.01）。单细胞RNA测序数据显示TSPAN33转录本在初始和记忆B细胞中几乎缺失，而在B细胞受体（BCR）活化后显著上调。

从结构角度看，TSPAN33的两个胞外环为适配体结合提供了可及性表位。TSPAN33适配体对活化B细胞的特异性赋予该偶联物三大治疗优势：增强靶向 engagement、降低免疫原性、临床适用性广。

5 局限性

本研究基于总CD19⁺B细胞进行分析，未来需探讨生发中心B细胞、记忆B细胞等特定亚群TSPAN33表达差异。糖基化模式可能随疾病阶段或治疗史变化，需纵向采样评估TSPAN33糖特征的稳定性。此外，补体激活和细胞因子释放仅进行体外评估，需在人性化小鼠模型中进行体内安全性验证。

6 临床意义

适配体引导的单抗平台具有模块化适应性，通过修改适配体序列或抗体效应结构域可扩展至其他自身抗体驱动疾病（如系统性红斑狼疮、重症肌无力）。TSPAN33还可作为药效学生物标志物监测治疗反应。

7 结论

本研究建立了包含糖蛋白组学分析、适配体筛选和双特异性偶联物构建的模块化治疗开发流程，为HT选择性B细胞耗竭提供了新一代治疗剂开发平台。研究结果支持进一步发展适配体-抗体偶联物作为器官特异性自身免疫疾病靶向免疫治疗平台。