妊娠激素通过心肌细胞PGC-1α/ERRα/VEGF通路增强心脏毛细血管密度的机制研究

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Pregnancy hormones increase cardiac capillary density via the PGC-1α/ERRα/VEGF pathway in cardiomyocytes

本研究发现妊娠激素（雌激素E2和孕酮P4）通过激活心肌细胞中PGC-1α/ERRα信号通路上调VEGF表达，直接促进心脏毛细血管增生而非间接通过心肌肥大。该机制不依赖经典核受体，为生理性心脏血管生成提供了新靶点，对治疗心肌缺血疾病具有转化意义。

　　

妊娠期母体心血管系统会发生显著的生理性适应，其特征包括心脏肥大和毛细血管密度增加。然而，这些适应性变化的分子机制尚未被完全阐明。本研究通过分析小鼠妊娠不同阶段及激素处理后的心脏，揭示了妊娠激素通过特定信号通路直接调控心脏毛细血管密度的新机制。

妊娠期心脏的可逆性肥大与毛细血管密度增加

研究聚焦于妊娠期心血管适应的两个方面：心脏重量增加（源于心脏肥大）和毛细血管化。对CD-1小鼠妊娠全程及产后一周的分析显示，与未孕（NP）小鼠相比，妊娠晚期（GD18）小鼠心脏体积显著增大。这种增大与血容量增加导致的负荷加重有关。研究发现，妊娠晚期血浆容量显著增加，产后恢复至未孕水平。心脏干重早在妊娠第7天（GD7）就显著增加，并持续至分娩。通过小麦胚芽凝集素（WGA）染色标记细胞膜，可在心脏横切面观察到心肌细胞（CM）的肥大。在细胞水平，通过测量CM横截面积（CSA）和长度发现，CSA在妊娠期间增加，在GD7时变得显著，并在产后第7天（P7）开始恢复；CM长度在GD14时显著增加。

由于适应性肥大会增加代谢需求和血液灌注，研究还评估了心脏毛细血管密度，通过量化妊娠和未孕小鼠心脏切片中凝集素GSL染色的毛细血管与CM的比率。结果显示，从GD7开始毛细血管密度显著增加，并在产后第0天（P0）达到峰值。

妊娠期心脏细胞增殖

鉴于妊娠能促进大脑神经发生，研究探讨了其是否也能诱导心脏细胞增殖。通过使用有丝分裂标记物Ki-67染色妊娠小鼠心脏切片，发现GD14小鼠心脏切片中存在多个Ki-67阳性细胞核，而未孕对照组中仅有少量阳性核。令人惊讶的是，这种增殖活动在分娩后（P0）立即停止。对Ki-67阳性心脏细胞核的量化显示，增殖在妊娠期间增加，在GD14达到峰值，之后下降。这一结果通过特异性M期标记物pHH3染色得到证实。

为了确定激素的影响，研究检测了动情周期不同阶段的心脏细胞增殖，发现在孕酮（P4）水平达到峰值的动情后期，Ki-67阳性心脏细胞数量最多，强烈提示E2和P4对心脏细胞周期活动的影响。

内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，而非心肌细胞

为了鉴定心脏中的增殖细胞类型，研究使用了不同的标记物进行共染色：GSL-I和波形蛋白（vimentin）用于内皮细胞（EC），明视野下的横纹用于CM，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白用于平滑肌细胞，单独波形蛋白用于成纤维细胞。GD14时的量化显示，大多数Ki-67阳性细胞是成纤维细胞（72.7 ± 1.1%）和内皮细胞（27.0 ± 1.1%），平滑肌细胞仅占很小比例（0.2 ± 0.1%），未检测到Ki-67阳性的CM。为了检测可能被组织学分析遗漏的少量、缓慢增殖的CM群，在妊娠第一周给孕鼠饮用水中加入BrdU。通过Langendorff灌注法分离这些小鼠心脏的单个CM并进行BrdU染色，未检测到CM中的DNA复制，证明妊娠期间CM的细胞周期活性没有增加。

P4和E2处理在无心脏肥大情况下增加毛细血管密度

为了确定导致心脏适应的妊娠激素并模拟其体内效应，研究测量了妊娠CD-1小鼠的激素水平，并将其与细胞周期活性相关联。E2水平在妊娠早期显著上升，中期下降，在GD18达到峰值，妊娠晚期和产后恢复至未孕水平。P4和催乳素的血浆水平在GD14前上升，之后下降。与Ki-67谱比较发现，P4和催乳素的血液水平与心脏细胞增殖率的变化最为相关。

接下来，研究探讨了应用模拟妊娠期激素谱的妊娠激素是否能诱导观察到的毛细血管密度增加。为此，在卵巢切除术后2周将激素缓释植入片植入小鼠体内。3周后，通过WGA和GSL-I染色测定毛细血管密度。结果显示，虽然单独释放E2或催乳素的植入片与安慰剂相比对毛细血管密度没有影响，但单独释放P4或E2与P4联合的植入片导致心脏毛细血管化显著增加。有趣的是，在任何条件下均未观察到CM横截面积的增加，表明妊娠诱导的毛细血管增殖不足以驱动心脏肥大。因此，毛细血管密度增加和心脏肥大似乎是两个独立的适应机制。

优化的激素处理方案增加雌雄小鼠毛细血管密度且不依赖肥大

从使用植入片的激素处理实验可知，E2和P4联合应用观察到的毛细血管密度增加最为显著。但测定这些小鼠的血浆激素水平发现，尽管植入片理论上持续释放，P4水平稳定下降且变异性高。为实现更一致的激素血浆水平，改为每天给雌鼠注射5 μg E2、1 mg P4或两者联合，持续14天。毛细血管密度测定显示，E2和P4联合处理效果最强，也导致E2和P4血浆水平最高，分别达到妊娠GD14生理水平的101%和62%。

根据此结果，将处理方案改为每天注射5 μg E2和1 mg P4（E2P4），持续14天。为测试此激素方案是否也能诱导雄鼠毛细血管增殖，对雄鼠进行相同处理。心脏切片染色显示，雄鼠毛细血管密度显著增加。与植入片实验一样，没有心脏肥大的迹象，因为心脏重量/胫骨长度比、CM横截面积和CM长度与对照组相比没有增加。处理14天后雄鼠P4血浆水平高于10 ng/mL，是对照组的五倍；E2血浆水平也显著增加。这表明该效应具有性别独立性，因为在处理14天的雌雄鼠中均明显。为理解毛细血管密度增加的动态，对雌雄鼠分别处理3天或7天。早在处理3天后，处理雄鼠就出现显著增加；处理7天后，雌鼠出现增加。同样，毛细血管密度的这种上升不伴随心脏肥大，CM横截面积测量与对照组无显著差异。

观察到的毛细血管密度增加可能源于EC增殖，因此通过pHH3免疫染色分析增殖率。处理7天后，处理小鼠心脏中pHH3阳性心脏细胞和EC增加；处理14天后，总增殖心脏细胞，尤其是EC的增加变得统计学显著，重现了在孕鼠心脏中的观察。为进一步验证此发现，在实验开始前给每只动物皮下植入充满BrdU溶液的微量渗透泵。BrdU在细胞周期S期的掺入使得能够研究14天处理期间的DNA合成活性。心脏切片进行BrdU和GSL-I抗体染色以显示EC。BrdU阳性细胞核的量化显示，激素处理后具有DNA合成活性的心脏细胞显著增加。BrdU阳性EC（通过GSL染色鉴定）的比例增加了2.8倍。总体而言，约26%的BrdU阳性细胞是EC，而大多数BrdU阳性细胞可能是成纤维细胞，与GD14小鼠心脏中的观察一致。激素处理期间EC增殖的增加与心肌毛细血管密度的增加相关，表明E2P4处理直接或间接增强了心脏中的EC增殖。

为测试激素处理是否对心脏特异或影响其他横纹肌，分离了处理14天雄鼠的胫骨前肌和膈肌，并像心脏切片一样测定毛细血管密度。有趣的是，在任何分析的骨骼肌中均未检测到毛细血管密度增加，表明E2P4处理后的观察效应仅限于心脏。

激素处理增加的毛细血管密度不通过核P4或E2受体信号传导

由于E2和P4联合诱导EC增殖，导致心脏毛细血管密度增加，研究试图阐明其潜在信号机制。两种激素主要通过核受体起作用。为确定雌鼠心脏中表达哪些激素受体，进行了定量实时PCR（qPCR）。在核受体中，既未检测到P4受体亚型PR-A和PR-B，也未检测到ERβ表达，而检测到少量ERα。在非核受体中，膜P4受体mPRα和mPRε以及催乳素受体（PRLR）均有表达。

为探讨核受体PR-A、PR-B和ERα的作用，用激素方案处理PR和ERα缺陷小鼠14天，并测定心脏毛细血管密度。发现E2P4处理后，PR以及ERα缺陷小鼠心脏毛细血管密度均增加，排除了这两种核受体的参与。此外，为研究PR信号在诱导EC增殖中的作用，使用PR-lacZ小鼠品系检测心脏中的PR表达。小鼠心脏中未检测到PR表达，但如预期，在作为阳性对照的子宫中检测到PR表达，从而证实了qPCR分析结果。

妊娠期和激素处理后促血管生成因子及其受体的上调

为深入了解导致心脏细胞增殖增加的机制，通过qPCR对妊娠小鼠和处理14天E2P4的未孕小鼠心脏中已知促血管生成基因的表达进行了分析。结果显示，在妊娠过程中以及E2P4处理后，VEGF-A、VEGF-B及其受体KDR/Flk-1和FLT-1均增加。在孕鼠中，VEGF-A和FLT1显示统计学显著增加，尤其是在妊娠后期，而KDR/Flk-1在妊娠中期增加。VEGF-B有增加趋势但未达到统计学显著性。然而，激素处理14天后，所有四种因子均显著增加。

VEGFs是有效的促血管生成因子，因此研究希望确定小鼠心脏中VEGF产生的细胞来源。对10周龄CD-1小鼠心脏切片进行免疫荧光染色显示，VEGF-A在α-辅助动蛋白（α-actinin）阳性的CM中表达。为鉴定VEGF-A和VEGF-B的细胞来源，将CD-1小鼠心脏通过CM去除法解离或通过Langendorff灌注法分离CM。从CM和非CM中制备RNA并进行qPCR分析。虽然CM和非CM都表达VEGF-A和B，但CM是这些促血管生成因子的主要来源。

据报道VEGF-A可诱导毛细血管通透性增加，因此检查了处理14天雄鼠和孕鼠（GD14）心脏切片的透射电子显微照片。对照组小鼠心脏毛细血管呈现典型的毛细血管壁结构，具有连续内皮和周围被基膜包围的周细胞。相比之下，在孕鼠心脏切片中观察到毛细血管的显著结构变化。这些毛细血管的内皮表现出明显的窗孔化，提示毛细血管通透性增加。此外，周细胞未被基膜完全包裹。在E2P4处理动物的心脏中，既检测到结构完整的毛细血管，也检测到表现出明显形态学改变的毛细血管。这些毛细血管显示显著的内皮窗孔化。与周细胞一起，它们仅被部分包裹的基膜所包围，基膜局部不连续或完全缺失，与孕鼠心脏中的毛细血管非常相似。因此，E2P4处理和孕鼠心脏中的毛细血管均表现出与VEGF-A驱动的血管生成一致的形态特征。

激素处理通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）通路增加毛细血管密度

VEGF在血管生成和毛细血管化中起关键作用。由于PGC-1α/ERRα信号已被证明可诱导心脏中VEGF的表达（CM是VEGF产生的主要细胞来源），研究接下来检验了该通路的参与。PGC-1α是一种转录共激活因子，可与孤儿核受体ERRα相互作用诱导其靶基因（如VEGF-A）的转录。qPCR分析显示，PGC-1α在妊娠过程中增加，在GD14达到峰值，并在E2P4激素处理14天后增加。ERRα表达在妊娠早期下调，并在妊娠过程中维持在对照水平。然而，ERRα在E2P4处理14天后显著上调。对H2B-mCherry小鼠（该品系所有CM细胞核均被mCherry荧光标记）心脏切片进行ERRα免疫染色，证明ERRα在CM细胞核中定位。PGC1-α与ERRα在CM细胞核中共表达。这些数据表明PGC1α/ERRα通路与CM中VEGF产生可能存在联系，这可能是E2P4处理后毛细血管密度增加的原因。

为检验PGC-1α/ERRα通路在心脏毛细血管化中的作用，研究使用了CM特异性PGC-1α基因敲除小鼠模型。在该模型中，floxed PGC-1α基因通过αMHC-Cre表达构建体在CM中被特异性敲除。用每日注射E2P4处理雄性αMHC-Cre/PGC-1α^flox/flox和PGC-1α^flox/flox小鼠2周，并测定毛细血管密度和CM大小。结果显示，PGC-1α^flox/flox对照组毛细血管密度显著增加，而PGC-1α敲除小鼠心脏毛细血管密度在激素处理后没有变化。这些数据证明，激活CM中的PGC-1α/ERRα通路是激素诱导毛细血管扩张所必需的，很可能通过CM分泌VEGF实现。总体而言，与PGC-1α^flox/flox对照组相比，PGC-1α敲除小鼠表现出心脏毛细血管化减少。此效应先前已有描述，并伴有肥大趋势，这在首次妊娠后显现。研究证实了PGC-1α敲除小鼠心脏中CM面积的总体增加。总之，这些发现确立了CM内在的、PGC-1α/ERRα依赖的机制，通过该机制E2P4处理增强心肌毛细血管化，且独立于肥大重塑。

讨论

妊娠期间，母体心脏通过增加毛细血管化和可逆性肥厚来应对增加的心脏需求。本研究探讨了这些适应现象的调控机制，重点关注妊娠期心脏增殖、肥大和激素变化。心脏增殖细胞百分比和毛细血管密度在GD3开始相较于对照组增加，在GD14达到峰值，并在分娩后立即停止。这伴随着CM肥大的增加。鉴于妊娠期E2和P4水平的升高，研究聚焦于这些妊娠激素及其信号通路，以阐明妊娠诱导心脏毛细血管化的基础。

为模拟妊娠激素的作用，研究表明E2和P4处理影响成年雌雄小鼠心脏中的EC增殖和血管化，但不影响CM大小。有趣的是，此效应具有心脏特异性，因为膈肌或胫骨前肌等骨骼肌在激素处理后未显示毛细血管化增加。激素依赖性调控增殖和分化在妊娠期多种细胞类型中已知。例如，已证明前脑脑室下区在妊娠期形成神经元祖细胞。P4已被证明能刺激妊娠期子宫内膜中的EC增殖以及卵巢切除小鼠注射P4后的子宫内膜血管生成。此外，最近对孕鼠心脏的转录组和蛋白质组分析揭示了与细胞增殖、胞质分裂和血管生成相关的基因增加，与本研究结果一致。在本研究设置中，通过三种不同方法（Ki-67、pHH3、BrdU）证明了妊娠期和P4处理后心脏EC增殖的增加，所有方法均给出相似结果。P4与E2联合时效果最大化，处理早在激素应用后3天就引起增殖显著增加，并持续增加至第14天（本研究终点）。选择此时间点是因为妊娠期内皮增殖在GD14达到峰值并在产后下降。E2P4处理后增殖性EC的快速增加以及此效应在P0日的迅速消退证明这是一种快速反应。这是E2和P4等类固醇激素的特征，快速动力学表明血容量过多不是心脏肥大和EC增殖的根本原因。事实上，E2和P4联合应用并未诱导心脏肥大。

接下来，研究调查了与妊娠激素触发的毛细血管密度增加相关的信号通路。由于妊娠小鼠和类固醇处理后心脏中VEGF及其受体表达增加，研究聚焦于其调控。VEGF是新血管形成的关键刺激物，对于通过血管生成发芽形成新毛细血管至关重要。心脏VEGF的缺失会导致心肌毛细血管化减少，继而引发缺血性心肌病。已有研究表明，妊娠期心脏血管生成的增加与VEGF基因表达增加相关。研究检测到E2P4诱导的VEGF及其受体表达，提示存在类似的VEGF驱动机制。这一点通过孕鼠和激素处理小鼠心脏毛细血管的形态得到证实，这些毛细血管表现出由VEGF介导的血管通透性增加的特征。由于激素诱导的VEGF表达与PGC-1α和ERRα表达增加相关，研究聚焦于该通路作为VEGF信号最可能的调控因子。PGC-1α是血管生成的潜在介质，通过共激活ERRα控制骨骼肌中VEGF的表达和分泌。在CM特异性PGC-1α敲除小鼠中已证明，该程序的缺失会导致孕后雌鼠心脏VEGF表达减少和毛细血管密度降低。用E2P4方案处理CM特异性PGC-1α KO小鼠未能增加毛细血管密度，表明存在CM依赖的旁分泌机制。CM旁分泌VEGF对于心脏血管网络形成的重要性已在CM特异性VEGF基因缺失小鼠中得到证明，这些小鼠表现出毛细血管密度严重下降和收缩功能障碍。研究推测骨骼肌细胞不响应E2P4处理分泌VEGF，因为毛细血管化具有心脏特异性，且小鼠膈肌或胫骨肌中未增加。然而，E2和P4诱导PGC-1α/ERRα通路的具体机制仍不清楚，因为令人惊讶的是，ER和PR缺陷小鼠在E2P4处理后仍显示毛细血管密度增加，排除了经典核激素受体信号传导。这些结果通过转基因PR-LacZ小鼠模型中未检测到小鼠心脏PR表达得到进一步证实。因此，实验结果暗示P4对PGC-1α存在非经典调控。先前在骨骼肌中已描述过PGC-1α通过β-肾上腺素能受体（其信号转导通过G蛋白）的此类机制。因此，在心脏中E2和P4也可能通过G_S蛋白偶联受体（如GPER或PAQR9）经由cAMP-PKA-CREB通路发出信号。这可以在未来的实验中通过测量CM中cAMP水平的变化和评估CREB的磷酸化状态来检验。在体内，可以通过在CM特异性敲除GPER和PAQR9的小鼠模型中测量E2P4的血管生成效应来解决此机制。此外，不能排除E2P4通过另一种心脏细胞类型对CM产生间接影响。E2P4可能刺激心脏内皮细胞或成纤维细胞分泌因子，进而刺激CM中的PGC-1α信号传导，导致VEGF分泌。

综上所述，数据揭示了妊娠如何特异性诱导母体心脏毛细血管增殖：妊娠期升高的E2和P4通过PGC1α/ERRα通路作用于CM，促进VEGF分泌和血管生成。出乎意料的是，此过程不需要经典的P4或E2核受体，提示这些激素存在非经典信号传导，正如在巨噬细胞中报道的那样。研究还表明，无论是妊娠激素E2和P4，还是增加的毛细血管化，都不足以驱动CM肥大，表明存在其他信号（很可能是血容量过多）导致后者。数据表明，在心肌灌注不足（如心肌缺血）的情况下，靶向CM中的这一新通路可能改善毛细血管化和血液灌注，而不伴随心脏肥大。