基于GC-IMS技术分析不同粗饲料对驴乳挥发性风味物质（VOCs）的调控机制与特征标志物筛选

本研究采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术，结合多变量统计分析，系统探究了玉米秸秆（G1）、麦壳（G2）和麦秸（G3）三种粗饲料对驴乳挥发性有机化合物（VOCs）组成及风味特征的影响。研究发现粗饲料类型显著改变驴乳中酯类、醛类等关键风味物质的含量，鉴定出13种相对气味活度值（ROAV>1）的特征风味化合物及23种潜在区分标志物，为通过膳食干预调控驴乳风味品质提供了理论依据。

　　

引言

作为全球基础营养来源，牛奶消费和乳制品利用自21世纪初以来呈现前所未有的增长。随着消费者追求高营养价值和多样化的乳制品，驴乳因其丰富的营养成分和独特风味而备受关注。驴乳被公认为优质乳制品，富含维生素C、溶菌酶、乳清蛋白和多不饱和脂肪酸（PUFAs）等必需营养素，并具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗糖尿病等多种健康促进特性。此外，驴乳具有怡人的奶油味、略带甜味且余味持久，因而成为乳制品市场的优选之一。

风味是影响消费者偏好的关键因素，由挥发性有机化合物（VOCs）共同构成，包括醛类、酮类、酯类、醇类、酸类、烃类和含氮化合物等。乳制品中的VOCs既来源于固有气味，也来自加工过程中的化学反应，如美拉德反应、焦糖化、脂质氧化、碳水化合物降解和蛋白质降解。在牛奶中，蛋白质、脂肪和碳水化合物等主要营养素受品种、饮食和季节性等多种因素影响。粗饲料作为草食动物饲料的重要组成部分，在塑造牛奶成分和风味方面起着关键作用。然而，关于粗饲料如何影响驴乳VOCs的研究仍有限。

气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）是一种先进的VOCs分析方法，具有灵敏度高、检测快速、操作简便和成本效益好等优点，被广泛应用于食品风味分析。本研究旨在采用GC-IMS和多变量统计方法，考察粗饲料对驴乳VOCs谱的影响，为通过膳食干预调控驴乳风味提供理论依据。

材料与方法

样品采集

聊城大学机构动物护理与使用委员会批准了所有动物实验（批准号：2023022706）。从27头健康、多产的5岁雌性驴（泌乳期60±15天，体重286±25 kg）采集生乳样品。将这些雌驴随机分为三组（每组9头），分别饲喂三种不同的粗饲料：玉米秸秆（G1）、麦壳（G2）或麦秸（G3）。三种粗饲料的近似成分如表1所示。日粮基本配方为：80.00%粗饲料，15.50%玉米，3.10%大豆，1.20%预混料和0.20%盐。除粗饲料外，其他饲料成分相同，驴自由饮水。驴饲养在同一半密集系统中，每天喂食两次（09:00, 16:00）。实验持续6周，前2周为适应期，后4周为正式期。实验结束时，从每头驴采集牛奶样品（10:00），立即冷冻并保存在-80°C直至GC-IMS分析。

GC-IMS分析

使用FlavorSpec?仪器（Gesellschaft für Analytische Sensorysteme GmbH, G.A.S., Dortmund, Germany）配备自动进样器单元（CTC-PAL, CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland）分析驴乳中的VOCs。将驴乳样品在4°C下解冻，取5 mL样品置于20 mL顶空玻璃瓶中，在60°C下以500 rpm旋转孵育15分钟。然后，自动注入500 μL顶空气体到设定为85°C的加热进样器中。气相色谱柱温度设为40°C，使用氮气（纯度≥99.999%）驱动顶空进入毛细管柱（MXT-5, 15 m × 0.53 mm × 1.0 μm）。载气流程序为：0–2分钟内增至2 mL/min，2–10分钟内增至20 mL/min，10–20分钟内最终增至100 mL/min。IMS仪器的漂移管长度为9.8 cm，漂移温度分别为60°C和45°C，漂移管电压设为5 kV，漂移气体为氮气（纯度≥99.999%），流速150 mL/min。采用3H电离，正离子模式。

VOCs分析

使用VOCal仪器分析软件、GC-IMS库和内置插件（Reporter和Gallery Plot）收集和分析驴乳VOCs数据。利用VOCal、美国国家标准与技术研究院（NIST）和软件内置GC-IMS数据库进行VOCs定性分析。所有样品重复分析三次。使用正酮C4-C9作为外参比，比较相同条件下样品的保留指数（RIs）。Reporter插件用于比较样品间的光谱差异，Gallery Plot插件用于比较不同样品的指纹图谱并分析VOCs差异。关键风味化合物指相对气味活度值（ROAV）≥1的化合物。ROAV计算中，无需区分同一VOCs的单体和二聚体，直接基于单体阈值合并浓度计算。相对含量采用面积归一化法计算。ROAV_max定义为对香气成分贡献最大的化合物的ROAV为100，其余组分的ROAV按公式（1）计算。

ROAV_i = (C_i / C_max) × (T_max / T_i) × 100

其中，C_i表示各VOCs的相对含量（%），相对含量（%）=物质峰面积/所有挥发性物质总峰面积×100；C_max表示对VOCs含量贡献最大的化合物的相对含量（%）；T_i表示各VOCs在水中的阈值（μg/kg）；T_max表示对VOCs含量贡献最大的化合物在水中的香气阈值（μg/kg）。

统计分析

使用SPSS 21.0版进行数据处理，采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey检验进行比较。结果以均值±标准误（SEM, n=9）表示，显著性设定为P<0.05。差异VOCs的识别标准为变量投影重要性（VIP）>1且P<0.05。使用GraphPad Prism 9.0可视化数据统计结果，利用MetaboAnalyst 5.0在线软件进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和热图分析。在MetaboAnalyst中，数据预处理采用总和归一化、对数变换和帕累托缩放。经上述标准化步骤后的相对强度为标准化强度，用于确保不同饮食组间VOCs差异比较的公平性和可重复性。

结果

VOCs谱

在驴乳中共检测到43种VOCs，如图1a和表2所示。这些VOCs分为八类：12种酯类、11种酮类、8种醛类、7种醇类、1种吡咯、1种烯烃、1种酸和2种未鉴定化合物，分别占总量的27.91%、25.58%、18.60%、16.28%、2.33%、2.33%、2.33%和4.65%（图1b,c）。酮类和酯类是最主要的VOCs，其次是醇类和醛类（图1d）。G1组的酯类和醛类水平显著高于G2和G3组（分别为P<0.05和P<0.001）。G1组的醇类水平显著高于G2组（P<0.05）。相反，G3组的烯烃水平显著高于G1和G2组，且G2组也显著高于G1组（P<0.001）。此外，G3组的吡咯水平显著低于G1和G2组（P<0.05）。

驴乳中的特征VOCs

在驴乳中鉴定出13种ROAV大于1的特征VOCs，如图2所示。这些化合物包括(E)-庚-2-烯醛、乙酸戊酯、(Z)-4-庚烯醛、庚醛、异硫氰酸烯丙酯、2-庚酮、己醛、3-己酮、硫氰酸甲酯、2-戊酮、乙酸乙酯、丁醛和2-丁酮。这些VOCs分为三类：5种醛类、4种酯类和4种酮类。其中，硫氰酸甲酯、乙酸乙酯和己醛对驴乳整体风味谱的贡献最为显著。此外，G2和G3组的(E)-庚-2-烯醛、(Z)-4-庚烯醛、庚醛、乙酸乙酯和丁醛的ROAV显著低于G1组，而异硫氰酸烯丙酯、2-庚酮、己醛、3-己酮和硫氰酸甲酯则相反（P<0.001）。G2组的2-戊酮（P<0.001）和2-丁酮（P<0.05）ROAV显著低于G1和G3组。G3组的乙酸戊酯ROAV大于G2和G1组，且G2组大于G1组（P<0.001）。

VOCs比较

通过二维谱、差异谱和三维谱直观展示了三组驴乳的VOCs谱（图3a-c）。以G1的二维谱为参考，将G2和G3的二维谱减去参考谱。红色表示浓度高于参考，蓝色表示浓度低于参考。G2和G3差异谱中的红蓝点表明与G1存在显著差异。指纹图谱分析进一步证实了每组驴乳VOCs的显著差异（图3d）。此外，戊-2-醇、乙酸乙酯-单体、丁醛、乙酸乙酯-二聚体、2-甲基丙酸乙酯-二聚体、2-甲基丙酸乙酯-单体、己醛-二聚体、庚-2-醇、(Z)-4-庚烯醛、(E)-庚-2-烯醛、己醛-单体和庚醛等化合物在G1组指纹区域表现出明显信号，表明与其他两组存在差异成分。

VOCs多变量分析

采用OPLS-DA有效区分了驴乳样品（图4a）。OPLS-DA模型表现出稳健性、准确性且无过拟合，验证结果满意（图4b）。OPLS-DA模型的VIP分析鉴定出23种VIP值大于1的差异VOCs（表3），分为六类：9种酯类、8种醛类、2种醇类、2种酮类、1种烯烃和1种吡咯。VOCs水平比较显示，(E)-庚-2-烯醛、(Z)-4-庚烯醛、2-辛醇、5-甲基-3-庚酮-二聚体、5-甲基-3-庚酮-单体、乙酸己酯、苯甲醛-单体、庚醛、己醛-二聚体、乙酸乙酯-单体、丁醛、2-甲基丙酸乙酯-二聚体和戊-2-醇在G2和G3组的浓度显著低于G1组（P<0.05）。此外，G2和G3组的1-水芹烯、硫氰酸甲酯-单体和异硫氰酸烯丙酯水平显著高于G1组。2-乙酰吡咯、苯甲醛-二聚体、乙酸乙酯-二聚体和2-甲基丙酸乙酯-单体的水平在G1组显著高于G2和G3组，且G2组高于G3组（P<0.05）。异丙基甲基膦酰氟和乙酸戊酯-二聚体在G3组的水平显著高于G1和G2组（P<0.05），且G2组高于G1组。己醛-单体水平在G1组显著高于G2和G3组，且G3组显著高于G2组（P<0.05）。

讨论

风味是消费者偏好的关键决定因素，也是牛奶品质的基本特征之一，主要由VOCs的特定组成定义。贡献牛奶独特风味的主要VOCs包括醇类、醛类、酮类和酯类。风味组学技术，特别是GC-IMS，已成为检测食品中VOCs的有效工具。本研究采用GC-IMS全面表征和比较了饲喂不同粗饲料的驴乳VOCs。在驴乳中共鉴定出43种VOCs，与使用GC-IMS在甘南不同地区牦牛奶中报告的34种VOCs一致。驴乳中VOCs数量较少可归因于全脂奶粉水分含量降低，通常会导致VOCs数量更多。同时，全脂奶粉中VOCs更丰富 due to reduced moisture content。此外，与GC-MS相比，GC-IMS更擅长检测低分子量化合物，从而增强了其对某些VOCs的灵敏度。驴乳中的主要VOCs是酯类、酮类、醛类和醇类，其中酮类和酯类浓度最高。这些发现与先前在不同泌乳阶段驴乳的GC-IMS研究一致。值得注意的是，驴乳中鉴定出12种酯类，与生牛奶中发现的3种酯类相比数量显著更多，表明酯类在驴乳中特别丰富。此外，饲喂玉米秸秆的驴乳中酯类、醛类和吡咯的水平显著高于饲喂麦壳和麦秸的驴乳。酯类和醛类的产生与乳脂肪中的游离脂肪酸密切相关，较高的脂肪酸水平导致酯和醛产量增加。研究还表明，粗饲料的脂质组成影响驴乳的脂质谱。日粮中较高的粗脂肪含量降低了短链脂肪酸的比例，但增加了单不饱和和多不饱和脂肪酸的比例。因此，驴乳中酯类和醛类水平的升高可能归因于本研究中提供的玉米秸秆的较高粗脂肪水平。本研究中，吡咯特指2-乙酰吡咯，是二羰基化合物与氨形成的缩合产物。牛奶中的乳糖是生成α-二羰基化合物的前体。先前的研究表明，用玉米青贮部分替代短苜蓿干草增加了干物质摄入量，从而提高了产奶量以及乳蛋白和乳糖产量。本研究中驴乳中吡咯水平的升高可能归因于所提供的玉米秸秆的较高干物质水平。相反，饲喂玉米秸秆的驴乳中烯烃浓度较低，尤其是1-水芹烯。牛奶中的1-水芹烯与牧场植物组成中的萜烯含量呈正相关。驴乳中烯烃水平较低可能归因于本研究中提供的玉米秸秆的较低烯烃水平。

每种VOC对整体风味的贡献可通过ROAV确定，ROAV>1的VOCs代表关键风味化合物。本研究在驴乳中鉴定出13种关键风味化合物，包括2-庚酮、己醛、乙酸乙酯和丁醛。先前的研究同样将这些化合物确定为牛奶风味的关键贡献者，表明驴乳和牛奶在风味特征上存在一定相似性。一些非萜烯VOCs可能从饲料直接转移到牛奶中。此外，当Tarantaise奶牛改变饮食并摄入蓍草后，乳脂肪中的单萜和倍半萜浓度逐渐增加，尽管持续摄入蓍草，随后却下降。因此，膳食成分中的VOCs和饲喂时间可能影响动物奶中VOCs的种类和含量，从而影响ROAV。

驴乳中的特征VOCs主要包括5种醛类、4种酯类和4种酮类。醛类和酮类因其低气味阈值而尤为显著，常见于乳制品中。醛类主要来源于美拉德反应和脂肪酸氧化过程。本研究中驴乳中鉴定出的脂肪醛包括(E)-庚-2-烯醛、(Z)-4-庚烯醛、庚醛、己醛和丁醛。这些化合物，尤其在低浓度下，与绿色、草本和青草香气相关。其中，ROAV排名第三的己醛赋予青草、绿色和略带醋味的香气。酯类化合物以低感知阈值为特征，对食品风味至关重要，贡献果香、花香和甜味。在牛奶中，酯类主要来源于乳脂肪中游离脂肪酸和醇的酯化反应。本研究中驴乳中鉴定的关键酯类化合物包括乙酸乙酸酯、异硫氰酸烯丙酯、硫氰酸甲酯和乙酸乙酯。值得注意的是，乙酸乙酯和硫氰酸甲酯对驴乳风味谱的影响最大。乙酸乙酯具有高感知阈值，贡献独特的菠萝气味，而硫氰酸甲酯则赋予大蒜香气。

样品间的VOCs差异可通过GC-IMS谱分析可视化，包括二维谱、差异谱和三维谱。这些可视化有助于直观、具体地比较样品间VOCs水平，指纹图谱是 particularly useful的工具。本研究中，饲喂不同粗饲料的驴乳表现出显著的光谱差异。指纹分析验证了这一点，揭示了特定VOCs的显著变异，如2-甲基丙酸乙酯、丁醛和乙酸乙酯，尤其在饲喂玉米秸秆的驴乳中与饲喂麦壳和麦秸的驴乳相比。直接影响风味的VOCs可能在消化道内（尤其是在瘤胃或肠道）被吸收，然后扩散到血液中并被输送到乳腺，或者通过肺部途径进入，被吸入肺部，进入血液，最终扩散到乳腺。瘤胃微生物负责乳脂肪中奇数和支链脂肪酸的产生。不同的饮食改变瘤胃发酵模式，从而驱动瘤胃微生物群落结构的变化。饲料发酵取决于内在饲料特性，麦秸和麦壳显示出相同的体外干物质消失率，但仍低于玉米秸秆。因此，麦秸和麦壳的特性相似，但两者与玉米秸秆的特性存在显著差异。研究表明，麦秸的低营养消化率可能归因于其与玉米秸秆相比更高的木质素含量以及更低的酸性洗涤纤维含量，这与本研究一致。先前的研究已成功采用GC-IMS指纹分析监测乳制品中VOCs动态，例如奶油奶酪成熟过程中的变化以及脂肪酸组成对4°C储存巴氏杀菌奶中VOCs的影响。多变量分析技术，包括热图可视化、PCA和OPLS-DA，常用于进一步分析样品差异。例如，通过GC-IMS结合多变量分析技术对高粱类型进行分类，其中OPLS-DA成功区分了品种内的显著样品变异。本研究中，OPLS-DA有效区分了驴乳样品间的VOCs差异。VIP值用于衡量每个变量对模型分类的贡献，VIP>1表明贡献显著。统计上，P值低于临界阈值0.05通常表示结果显著，而P值高于该阈值则表明缺乏显著性。在驴乳中共鉴定出23种差异VOCs，其中2-甲基丙酸乙酯、丁醛和乙酸乙酯等化合物的结果与指纹分析一致。这些发现表明，驴乳的VOCs谱可根据饲喂动物的粗饲料发生显著变化，与先前关于饲料类型对牛奶成分影响的研究一致。

结论

风味，尤其是VOCs，是直接影响消费者选择和接受度的关键因素之一。某些饲料可能引入不愉快气味或增强愉快气味，进而指导饲料配方的优化并避免驴乳风味缺陷。采用GC-IMS和多变量分析分析比较了不同类型粗饲料对驴乳VOCs的影响。在七类中共检测到43种VOCs。其中，13种化合物，包括硫氰酸甲酯、乙酸乙酯和己醛，被选为特征风味化合物。此外，鉴定出23种VOCs作为潜在标志物，以区分饲喂不同类型粗饲料的驴乳。驴乳中的VOCs，尤其是酯类和醛类，主要受饲喂驴的粗饲料类型影响。本研究结果为了解不同粗饲料类型如何影响驴乳VOCs组成提供了见解，为驴乳生产中的VOCs调控提供了理论基础。