猪链球菌VII型分泌系统新型毒性效应蛋白MSE-ExTs的鉴定及其通过非经典EIC-CR/EssC D1结构域互作途径增强细菌竞争适应性的机制研究

本研究发现猪链球菌（Streptococcus suis）VII型分泌系统（T7SSb）可输出一类新型毒性效应蛋白MSE-ExTs（Marker for Searching Effectors - Exported Toxins），其多为缺乏N端YeeF结构域的片段化毒素，但依然具备分泌能力与细菌间拮抗功能。研究揭示了效应蛋白配对免疫蛋白的C端保守区（EIC-CR/DUF6572）通过其“YxxxD”靶向信号与T7SS核心组分EssC的D1 ATPase结构域互作，从而激活分泌通道的非经典途径，确保了即便在缺乏同源全长EssC的情况下效应蛋白的成功递送，显著拓宽了对T7SSb分泌机制及其在细菌定植中作用的理解。

　　

背景

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病原体，对养猪业和公共卫生构成严重威胁，可引发败血症和脑膜炎等严重疾病。VII型分泌系统（Type VII Secretion System, T7SS）通过递送毒性效应蛋白在细菌间竞争中发挥关键作用，对于猪链球菌有效定植宿主扁桃体至关重要。尽管已在不同细菌物种中鉴定出多种T7SS效应蛋白，但其生物学活性仍不足以完全解释T7SS功能的多样性，提示尚有许多未知效应蛋白有待研究。

方法

本研究使用的猪链球菌菌株包括K56-WJ、K11-WJ和128-2-1。采用分子克隆、基因敲除、回补实验、细菌双杂交（BACTH）、蛋白质pull-down、表面等离子共振（SPR）、Renilla荧光素酶（RluC）易位测定、Western blot、细菌生长曲线测定、细菌间竞争实验以及细胞内NAD⁺水平测定等多种技术手段。生物信息学分析涉及序列比对、系统发育树构建、蛋白质结构预测（AlphaFold、SWISS-MODEL、Phyre2）和分子对接（Cluspro 2.0, Autodock Vina）等。

结果

鉴定出一种在猪链球菌中介导细菌间拮抗作用的毒性效应蛋白

在猪链球菌K56-WJ菌株的T7SSb基因座中发现一个Imm59家族免疫蛋白（JNE31_RS01430），其上游蛋白（JNE31_RS11280）被预测为潜在效应蛋白。该效应蛋白表达对大肠杆菌具有强烈毒性，其毒性可被共表达的免疫蛋白所中和，证实二者构成效应蛋白-免疫蛋白对（MSE-ExT1和EI1）。细菌间竞争实验表明，MSE-ExT1能赋予猪链球菌杀伤敏感菌株的能力，包括从健康猪扁桃体微生物群中筛选出的ExT1敏感分离株，提示其在扁桃体定植中获得竞争优势的潜力。分泌实验证实MSE-ExT1的分泌依赖于完整的T7SSb装置（如EsaA, EssC1）。

MSE-ExTs携带多样化的NADase毒素并在猪链球菌中广泛存在

通过生物信息学检索，在猪链球菌基因组中鉴定出超过300个含有保守N端MSE序列的蛋白质，其C端融合了多样化的毒素结构域。系统发育分析将104个代表性样本的C端毒素分为13个不同的进化枝（ExT1-13）。随机选取的MSE-ExT7和MSE-ExT12也被实验证实为功能性T7SSb毒性效应蛋白。绝大多数ExT毒素域（除ExT8, 10, 13外）在序列和结构上与已知的NADase（NAD⁺水解酶）具有相似性，能够消耗细胞内NAD⁺。实验证实ExT1, ExT7, ExT12的表达可显著降低大肠杆菌细胞内NAD⁺水平，此活性可被其对应的免疫蛋白中和。

鉴定与MSE-ExTs相关的小螺旋蛋白

遗传邻域分析发现，部分MSE-ExTs与N端 divergent YeeF（LXG-like）结构域融合，形成YeeF-MSE-ExTs，提示典型MSE-ExTs可能是YeeF相关效应蛋白的片段。大多数MSE-ExTs（67.39%）和YeeF-MSE-ExTs（26.15%）编码在截短的essC基因下游。这些基因座上游编码不同的保守小螺旋蛋白：典型mse-exts上游存在mapABC基因，而yeeF-mse-exts上游存在yapABC基因。MapC1、YapA、YapC被预测为WXG100-like蛋白。MapC2虽无典型WXG100-like结构，但含有“YxxxD”靶向信号。Pull-down实验表明MapC2特异性结合MSE序列，而MapC1特异性结合YeeF结构域。

免疫蛋白C端保守区（EIC-CR）对MSE-ExTs的递送起关键作用

系统发育分析显示免疫蛋白与其对应的ExT毒素分类一致。大多数免疫蛋白具有一个保守的C端区域（EIC-CR，后注释为DUF6572结构域）。免疫实验表明，免疫蛋白的N端区域（EI-N）负责中和毒素毒性，而EIC-CR与此基本功能无关。基因敲除实验发现，单独删除eic-CR或mapBC2并不能完全消除MSE-ExT1介导的竞争活性，但同时删除eic-CR和mse或mapC2则完全消除了竞争优势。RluC易位实验表明，将mapC2或eic-CR与mse融合能显著增强报告蛋白的分泌，且此过程依赖于其“YxxxD”信号肽。

EIC-CR/DUF6572特异性与EssC的D1 ATPase结构域相互作用

细菌双杂交和Pull-down实验证实，EIC-CR和MapC2能与EssC1的N端片段、截短的EssC2和EssC3相互作用。序列比对显示三者共享相同的D1 ATPase结构域。进一步的Pull-down和SPR分析确证了EIC-CR和MapC2与EssC1的D1结构域特异性结合，而不与D2结构域结合。竞争实验表明，只有敲除essC1（编码全长EssC蛋白）会削弱MSE-ExT1的杀伤能力，说明效应蛋白的递送依赖于EIC-CR/MapC2与EssC1 D1结构域的互作。结构预测和分子对接显示EIC-CR和MapC2结构高度相似，并能通过包含“YxxxD” motif在内的多个残基与D1结构域形成氢键网络。

讨论

本研究在猪链球菌中鉴定出一类新型T7SSb效应蛋白MSE-ExTs，它们多为编码在截短EssC变体下游的片段化毒素，但依然具有NADase活性和细菌间拮抗功能。研究创新性地发现，效应蛋白配对免疫蛋白的C端保守区EIC-CR（DUF6572）以及上游小蛋白MapC2，通过其保守的“YxxxD”靶向信号，能够直接与T7SS核心装置中非相邻的全长EssC1的D1 ATPase结构域结合，从而激活分泌系统。这种非经典途径绕过了对同源全长EssC或典型WXG100-like/LXG结构域的依赖，确保了在频繁基因重排产生的截短essC基因座下游效应蛋白的成功递送。这种由EIC-CR/MapC2介导的替代性招募策略在多种革兰氏阳性菌中存在，扩展了对T7SSb分泌机制的理解，并揭示了其通过递送NADase等毒素在细菌定植和竞争中扮演重要角色。效应蛋白-免疫蛋白对中部署多重伙伴/适配器的策略，有效降低了因基因突变或蛋白降解导致效应蛋白分泌中断的风险。

结论

本研究鉴定并阐明了一类新型T7SSb效应蛋白MSE-ExTs在猪链球菌中的功能及其独特的分泌机制。研究提出了一个模型：对于编码在截短essC下游的MSE-ExTs，其可通过MapC2（与MSE互作）或EIC-CR（作为效应蛋白-免疫蛋白复合物的一部分）两种途径被招募至T7SSb装置，通过激活核心EssC1的D1 ATPase域，最终完成效应蛋白的跨膜转运。这一替代策略凸显了T7SSb在效应蛋白递送机制上的灵活性，为理解细菌分泌系统在适应性和进化中的作用提供了新的视角。